miR?199a通過Wnt3a/β?catenin信號(hào)通路調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)

莊煥偉 白樹堂 符洪犢 曹賢君 梁麗明 陳知群 羊家慧 歐陽華 程弦 張亮

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院心胸外科（?？?70208）；2中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院胸外科（廣東深圳518107）

據(jù)2018年WHO 最新統(tǒng)計(jì)，肺癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率超過11%，在所有惡性腫瘤中位居第一［1］。根據(jù)組織學(xué)特征，肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung carcinoma，NSCLC），其中NSCLC 在肺癌發(fā)病人群中占80%以上［2-3］。目前，臨床上對(duì)于肺癌的治療主要以手術(shù)加化療為主，但預(yù)后差，尤其是化療對(duì)人體毒副作用較大，基因靶向治療被認(rèn)為是更精確、安全的治療方式，其中RNA 干擾和microRNA 等新型靶向基因技術(shù)在惡性腫瘤的臨床治療中顯示出很好的應(yīng)用前景。

小分子RNA（microRNA，miRNA）是真核生物細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)約22 個(gè)核苷酸序列的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，主要通過與目標(biāo)基因的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）結(jié)合，發(fā)揮刺激或抑制mRNA 翻譯的作用［4］。miR?199a 是一類在人類細(xì)胞中廣泛存在的基因家族，在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，并能調(diào)控多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移和耐藥等生物學(xué)過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)［5-6］。但其對(duì)NSCLC 細(xì)胞的生物學(xué)活性是否有調(diào)控作用鮮有報(bào)道。本研究探討miR?199a 對(duì)NSCLC 細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲過程的影響及其可能存在的作用機(jī)制，為臨床上NSCLC 的基因治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器正常肺上皮細(xì)胞BEAS?2B和NSCLC 細(xì)胞A549均購自中科院上海細(xì)胞庫；RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；miR?199a?mimics、miR?199a?NC 及miR?199a?inhibito引物序列（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；Lipo?fectamineTM2000（Invitrogen，美國(guó)）；Annexin V?FITC/PI 凋亡試劑盒購自南京Beyotime 公司；CCK?8 試劑盒、EdU 試劑盒購自杭州四季青公司；、鼠抗人Wnt3a、β?catenin、C?myc、Survivin、E?cadherin、Vi?mentin 單克隆抗體，羊抗兔二抗購自美國(guó)Invitro?gen 公司；Trizol 購自美國(guó)Invitrogen 公司。

1.2 RT?PCR 檢測(cè)正常肺上皮細(xì)胞BEAS?2B 和NSCLC 細(xì)胞A549 內(nèi)miR?199a 的表達(dá)解凍、復(fù)蘇正常肺上皮細(xì)胞BEAS?2B 和NSCLC 細(xì)胞A549，重懸于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2～3 d 傳代1 次，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，Trizol 提取總RNA，異丙醇處理后收集RNA 沉淀，75%乙醇洗滌，離心，棄上清液，DEPC 水溶解RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，以β?actin 為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行灰度掃描分析，比較目的基因與β?actin 條帶灰度之比。miR?199a 上游引物序列：5′?TAGGCTTAGCTAGGCTAGGT?3′，下游序列5′?TCGATTGCTAGGCTAGCC?CA?3′；β?actin 引物序列：5′?TAGCTTCGGCATTAG?CTAAC?3′，下游序列5′?TAGGCTTAGCTTAGGCTA?GC?3′。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將凍存的NSCLC細(xì)胞A549解凍、復(fù)蘇，重懸，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6 孔板，調(diào)整密度為5×105個(gè)/孔，在不含雙抗和胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，后根據(jù)LipofectamineTM2000 試劑盒說明書所示步驟，將miR?199a?mimics、miR?199a?NC 及miR?199a?inhibi?tor 序列分別轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞內(nèi)，根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同，將細(xì)胞分為3 組，分別為mimics 組、NC 組及in?hibitor 組，轉(zhuǎn)染6 h 后，將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.4 CCK?8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96 孔板，每孔內(nèi)加入含2×103個(gè)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，于轉(zhuǎn)染24、48、72 和96 h 后，向每個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入90 μL 的完全培養(yǎng)基和10 μL 的CCK?8 試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，以此代表細(xì)胞增殖活性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.5 Annexin V?FITC/PI 聯(lián)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，用預(yù)冷PBS 洗滌2 次，將細(xì)胞重懸于緩沖溶液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，根據(jù)凋亡試劑盒說明書中所示步驟，向100 μL 細(xì)胞緩沖液中加入5 μL Annexin V?FITC 和5 μL PI，避光孵育15 min 后，每管內(nèi)加入400 μL 緩沖液，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡情況。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液，用滅菌的移液槍頭垂直于6 孔板底部劃直線，PBS 沖掉脫落細(xì)胞，于顯微鏡拍攝并測(cè)量劃痕寬度，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h 后再次于顯微鏡下觀察并測(cè)量劃痕寬度，以24 h 與0 h 劃痕寬度之比代表細(xì)胞遷移能力，比值越大，代表細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)，反之越弱。每組細(xì)胞設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔進(jìn)行。

1.7 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力向24 孔Transwell 小室的上室中加入預(yù)配的Matrigel基質(zhì)膠（50 μL/孔），細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL，以100 μL 體積接種于Transwell 小室的上室，下室內(nèi)加入含血清的培養(yǎng)基600 μL，將小室置于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育48 h，去除小室，洗膜、固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于24 孔板，用LipofectamineTM2000 將熒光素酶報(bào)告載體（Wnt3a?3′?UTR?WT 或Wnt3a?3′UTR?MT）與miR?199a?mimics/inhibitor/NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以Renilla 熒光素酶質(zhì)粒（100 ng/孔）為對(duì)照，與載體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)（Promega）檢測(cè)熒光素酶活性。

1.9 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Wnt3a、β?catenin、C?myc、Survivin、E?cadherin 和Vimentin 蛋白表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，收集各組細(xì)胞，RIPA 裂解液提取總蛋白，將蛋白樣品加入SDS?PAGE 凝膠加樣孔進(jìn)行電泳，使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶室溫封閉2 h，TBST 溫和洗膜3 min 后加入相對(duì)應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌10 min×3 次，加入二抗，室溫下孵育1 h，TBST 洗滌10 min×3 次，加入配制好的ECL 發(fā)光液，避光孵育5 min，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀中采集圖片信息，圖片用Image pro plus 6.0 軟件進(jìn)行灰度分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組計(jì)量資料間比較采用ANOVA 檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR?199a 在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常肺上皮細(xì)胞正常肺上皮細(xì)胞BEAS?2B 中miR?199a的相對(duì)表達(dá)量為（0.83±0.04），NSCLC 細(xì)胞A549中miR?199a 的相對(duì)表達(dá)量為（0.31±0.02），顯著低于正常肺上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)（P<0.05）。見圖1。

圖1 RT?PCR 檢測(cè)正常肺上皮細(xì)胞BEAS?2B 和NSCLC細(xì)胞A549 內(nèi)miR?199a 的表達(dá)Fig.1 RT?PCR detection of miR?199a expression in normal lung epithelial cells BEAS?2B and non?small cell lung cancer cells A549

2.2 miR?199a 能抑制NSCLC 細(xì)胞的增殖自轉(zhuǎn)染48 h 起，mimics 組細(xì)胞增殖活力顯著低于其他兩組（P< 0.05），而inhibitor 組細(xì)胞的增殖活力在3 組中最高（P< 0.05），這種趨勢(shì)一直持續(xù)至96 h。見圖2。

圖2 CCK8 法檢測(cè)miR?199a 對(duì)A549 細(xì)胞增值率的影響Fig.2 CCK8 assay to detect the effect of miR?199a on the proliferation rate of A549 cells

2.3 miR?199a能促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的凋亡細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，inhibitor組細(xì)胞凋亡率為（3.32±0.44）%，NC組細(xì)胞凋亡率為（13.93±0.73）%，mimics 組細(xì)胞凋亡率為（25.10±0.56）%。其中inhibitor 組凋亡率低于其他兩組（P< 0.05），mimics 組細(xì)胞凋亡率顯著高于其他兩組（P<0.05）。見圖3。

圖3 PITC/PI 聯(lián)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR?199a 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 PITC/PI combined with flow cytometry to detect the effect of miR?199a on the apoptosis rate of A549 cells

2.4 miR?199a 能抑制細(xì)胞遷移和侵襲劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR?199a 對(duì)A549 細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，24 h 后mimics 組細(xì)胞劃痕寬度為0 h的（28.74±1.26）%，NC 組為（63.63±3.22）%，顯著高于mimics 組（P< 0.05），inhibitor 組為（93.48±2.88）%，在3 組中為最高（P<0.05），見圖4。

Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR?199a 對(duì)A549 細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，mimics 組單位面積內(nèi)穿過小室纖維膜細(xì)胞數(shù)為（98.83±9.70）個(gè)，NC 組單位面積內(nèi)穿過小室纖維膜細(xì)胞數(shù)為（27.39±4.66）個(gè)，顯著低于mimics 組（P< 0.05），inhibitor組單位面積內(nèi)穿過小室纖維膜細(xì)胞數(shù)為（11.86±2.01）個(gè)，顯著低于其他兩組（P<0.05），見圖5。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同組別細(xì)胞遷移能力Fig.4 Scratch test to detect cell migration ability in different groups

圖5 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR?199a 對(duì)A549 細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.5 Transwell chamber experiment to detect the effect of miR?199a on the invasion ability of A549 cells

2.5 miR?199a 靶向抑制A549 細(xì)胞中Wnt3a 的表達(dá)為了確定miR?199a 在A549 細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)功能的靶向作用點(diǎn)，筆者使用TargetScan 軟件篩選miR?199a 潛在下游靶向蛋白，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR?199a 與Wnt3a 保守位點(diǎn)有高分?jǐn)?shù)結(jié)合（圖6A），Wnt3a 為miR?199a 的一個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。本研究雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示，miR?199a?mimics抑制了A549 細(xì)胞中Wnt3a?3′?UTR?WT 報(bào)告基因的熒光素酶活性，而miR?199a?Inhibitor 刺激了Wnt3a?3′?UTR?WT 報(bào)告基因的熒光素酶活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），而在轉(zhuǎn)染突變載體的細(xì)胞內(nèi)沒有觀察到熒光素酶活性改變，表明Wnt3a是miR?199a 的直接靶向蛋白見（6B）。同時(shí)，用Western blot 檢測(cè)了miR?199a 表達(dá)不同的細(xì)胞內(nèi)Wnt3a 的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了miR?199a mimics的細(xì)胞內(nèi)Wnt3a的表達(dá)顯著低于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組細(xì)胞（P< 0.05），而轉(zhuǎn)染miR?199a 抑制劑的細(xì)胞內(nèi)Wnt3a 的表達(dá)顯著高于其他兩組（P<0.05，圖6C、D）。

圖6 miR?199a 靶基因確定Fig.6 Identification of miR?199a target gene

2.6 miR?199a 能刺激A549 細(xì)胞內(nèi)E?cadherin 表達(dá)，抑制Vimentin、β?catenin、C?myc、Survivin的蛋白表達(dá)Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的A549 細(xì)胞中Wnt 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR?199a 類似物的細(xì)胞中，E?cadherin 表達(dá)顯著高于NC 組細(xì)胞，而Vimentin、β?catenin、C?myc、Survivin 的表達(dá)低于NC 組細(xì)胞，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），轉(zhuǎn)染miR?199a 抑制劑的細(xì)胞內(nèi)，E?cadherin 表達(dá)低于NC 組細(xì)胞，而Vimentin、β?catenin、C?myc、Survivin 的表達(dá)高于NC 組細(xì)胞，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖7。

3 討論

miR?199a 被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中作為癌基因或抑癌基因異常表達(dá)，同時(shí)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常組織，miR?199a 在肝癌、膀胱癌、食管癌等多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯低于正常組織，miR?199a表達(dá)增加后，腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)受到抑制，凋亡率顯著增加［7-8］，說明miR?199a 在這些腫瘤組織內(nèi)發(fā)揮抑制基因的作用。SAKAGUCHI 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，miR?199a 通過靶向作用ITGA3 抑制膀胱癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲；ZHOU 等［10］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR?199a 通過CCR7調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，發(fā)揮抑癌基因的作用；PHATAK等［11］報(bào)道稱miR?199a?3p通過靶向p21 激酶4 降低食管癌細(xì)胞增殖活性。本研究為了探討miR?199a 對(duì)NSCLC 細(xì)胞的生物學(xué)功能是否有調(diào)控作用，首先檢測(cè)了其在正常肺上皮細(xì)胞和NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR?199a在NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于正常肺上皮細(xì)胞，同時(shí)，本研究檢測(cè)了miR?199a 表達(dá)程度不同的A549 細(xì)胞的生物活性，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR?199a的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲活性均顯著低于低表達(dá)miR?199a 的細(xì)胞，而凋亡率顯著上升，而低表達(dá)miR?199a 的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲活性增強(qiáng)，凋亡率下降，以上結(jié)果提示miR?199a 在NSCLC 中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。

為了進(jìn)一步探究miR?199a 對(duì)NSCLC 細(xì)胞的作用機(jī)制，筆者在miRNA 數(shù)據(jù)查詢發(fā)現(xiàn)Wnt3a 3′?UTR 中存在其目標(biāo)堿基序列。Wnt/β?catenin 信號(hào)通路在腫瘤細(xì)的增殖、凋亡及間質(zhì)化過程中發(fā)揮重要作用，該通路的異常激活與多種癌癥的發(fā)生有密切關(guān)系，其中Wnt3a 是該通路的重要配體之一［12］，多項(xiàng)研究顯示，Wnt3a 參與了NSCLC 的病理過程，YU 等［13］證實(shí)CSF?1R 通過Wnt3a 信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)NSCLC 細(xì)胞的擴(kuò)散；HAN 等［14］發(fā)現(xiàn)銀杏外種皮提取物通過Wnt 3a/β?catenin 信號(hào)通路抑制Lewis 肺癌發(fā)生。本研究中，用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR?199 可明顯減弱野生型Wnt3a3′?UTR的熒光酶活性，而對(duì)突變型Wnt3a3′?UTR 的熒光酶活性無影響，同時(shí)，轉(zhuǎn)染miR?199a 類似物的細(xì)胞內(nèi)Wnt3a 的蛋白水平顯著低于轉(zhuǎn)染miR?199a 抑制序列的細(xì)胞，提示miR?199a 可靶向抑制Wnt3a的表達(dá)。

為了進(jìn)一步研究miR?199a 對(duì)NSCLC 細(xì)胞調(diào)控作用的分子機(jī)制，本研究在3 組miR?199a 不同表達(dá)的A549 細(xì)胞中檢測(cè)了一系列Wnt3a/β?catenin 信號(hào)通路的下游分子。當(dāng)Wnt 信號(hào)通路被異常激活時(shí)，β?catenin 在細(xì)胞內(nèi)逐漸聚集，繼而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)聚集，激活下游一系列靶基因的表達(dá)，既往研究［15］表明，β?catenin 在A549 細(xì)胞中高表達(dá)，對(duì)維持A549 細(xì)胞增殖和克隆形成能力有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著Wnt3a 在miR?199a?mimics組細(xì)胞中被抑制，β?catenin 的表達(dá)也隨之減弱，同時(shí)，miR?199a?inhibitor 組細(xì)胞內(nèi)β?catenin 表達(dá)較miR?199a?NC 組顯著增加。C?myc 是Wnt/β?catenin通路的一個(gè)下游靶基因，其在細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖過程中能使細(xì)胞無限增殖，獲得永生化能力，并且能促進(jìn)細(xì)胞分裂［16-17］。Survivin 是Wnt/β?catenin 通路的另一個(gè)靶基因，主要表達(dá)于胚胎組織及腫瘤細(xì)胞中，屬于凋亡抑制蛋白，其主要在細(xì)胞周期的G2/M 期發(fā)揮作用，通過抑制caspase?3 的活性而阻斷細(xì)胞的凋亡［18-19］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR?199a能抑制A549 細(xì)胞內(nèi)C?myc、Survivin 的表達(dá)，提示miR?199 對(duì)A549 細(xì)胞增殖、凋亡的影響可能是通過Wnt/β?catenin 通路對(duì)C?myc、Survivin 的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的。

EMT 指源于上皮的腫瘤細(xì)胞失去極性而向具有間質(zhì)表型細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，在此過程中，上皮細(xì)胞黏附性降低，極性消失，使細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強(qiáng)［20-21］，Wnt/β?catenin 信號(hào)通路是導(dǎo)致EMT的重要因素［22］，EMT過程的重要標(biāo)志是細(xì)胞內(nèi)上皮細(xì)胞的主要成分上皮型鈣黏蛋白（E?cadherin）表達(dá)下降，間質(zhì)細(xì)胞的主要成分波形蛋白（Vimentin）等能刺激細(xì)胞移動(dòng)的蛋白表達(dá)上調(diào)，二者都為Wnt/β?catenin信號(hào)通路的下游蛋白［23-25］。本研究檢測(cè)了miR?199a 對(duì)E?cadherin、Vimentin 表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR?199a 能抑制二者在A549 細(xì)胞中的表達(dá)，這種抑制作用可能是通過對(duì)Wnt/β?catenin通路活性的下調(diào)而實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)也進(jìn)一步解釋了miR?199a 對(duì)A549 細(xì)胞的遷移、侵襲活性下調(diào)的分子機(jī)制。

本研究探討了miR?199a 對(duì)NSCLC 細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)的調(diào)控作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，不足之處在于范圍只限于細(xì)胞水平，而未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。本課題組在下一步的研究中會(huì)探究miR?199a 在NSCLC 組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征間的關(guān)系，為miR?199a 在非小細(xì)胞肺腺癌中發(fā)揮作用提供更充足的證據(jù)。綜上所述，miR?199a能抑制NSCLC A549 的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)刺激其凋亡，這種作用可能是通過靶向抑制Wnt3a/β?catenin 信號(hào)通路的活性而實(shí)現(xiàn)的。

圖7 Western blot 檢測(cè)miR?199a 對(duì)A549 細(xì)胞內(nèi)E?cadherin、Vimentin、β?catenin、C?myc、Survivin 的蛋白表達(dá)Fig.7 Western blot detected miR?199a protein expression of E?cadherin，Vimentin，β?catenin，C?myc，and Survivin in A549 cells