預(yù)針刺對AD樣大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及TLR4/NF?κB信號通路的影響

何川 黃重生 陳虹茹 余超超 鄭清 王月燊 陳蕓蕓 孔立紅

1湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院（武漢430061）；2針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心（武漢430061）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種與衰老相關(guān)的進行性神經(jīng)退行性疾病，以記憶喪失和多種認知功能障礙為特征，是發(fā)病率最高的癡呆類型［1］。AD 的發(fā)病機制復(fù)雜，淀粉樣斑塊沉積和神經(jīng)元纖維纏結(jié)是AD 主要的病理學(xué)特征，神經(jīng)炎性反應(yīng)是AD 發(fā)生的重要因素［2-3］。小膠質(zhì)細胞（microglia，MG）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的免疫細胞，研究發(fā)現(xiàn)多種刺激因素可通過TLR4/NF?κB信號通路激活MG，釋放炎癥因子，加重神經(jīng)炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致認知功能的惡化［4-5］。

AD 起病隱匿，尚無有效逆轉(zhuǎn)病理進程的治療手段，因此采取有效措施早期干預(yù)或許能阻止或延緩AD 病理進程。針灸在防治神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著重要作用［6］。衰老會導(dǎo)致神經(jīng)炎癥反應(yīng)增強，因此在機體衰老過程中進行針灸同步干預(yù)是否能通過TLR4/NF?κB 信號通路減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而緩解認知功能損傷，目前國內(nèi)外相關(guān)文獻報告較少。本實驗通過建立AD 樣大鼠模型（亞急性衰老模型），使用預(yù)針刺干預(yù)，檢測大鼠海馬區(qū)TLR4/NF?κB 信號通路相關(guān)分子表達情況，以闡明預(yù)針刺早期防治AD 樣神經(jīng)炎癥的可能機制，為針灸早期防治AD 提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組清潔級3 個月齡SD 雄性大鼠，體質(zhì)量360～390 g，由湖北省實驗動物研究中心提供（許可證號：SCXK（鄂）2015?0018）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、治療組，每組12 只。實驗過程中嚴格遵守《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中有關(guān)規(guī)定。

1.2 主要儀器和主要試劑針灸針（北京中研太和醫(yī)療器械有限公司），HANS?100 A 電針儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司），Morris 水迷宮（成都泰盟），石蠟切片機（廣州三元科技有限公司），電泳儀（北京市六一儀器廠，型號：DYY?6C），激光共聚焦顯微鏡（德國Leica，型號：TCS SP8）；酶標儀（芬蘭（Labsystems Multiskan MS）公司產(chǎn)品型號：352 型）；兔抗TLR4、NF?κB P65 抗體、Iba?1 一抗、山羊抗兔IgG H&L（Cy3?）預(yù)吸附二抗（英國Ab?cam）；IL?1β ELISA 試劑盒（貨號：RA20020）、IL?6 ELISA 試劑盒（貨號：RA20607）、TNF?α ELISA 試劑盒（貨號：RA20035），均為Bioswamp 公司。

1.3 造模方法采用D?半乳糖腹腔注射制備AD樣大鼠模型。大鼠稱重后，模型組與治療組腹腔注射D?半乳糖［120 mg/（kg·d）］，連續(xù)8 周。在實驗的過程中通過對大鼠狀態(tài)的觀察，發(fā)現(xiàn)與正常組比較，模型組大鼠均出現(xiàn)毛發(fā)脫落增多，毛發(fā)枯黃粗糙，食量減少，體質(zhì)量減輕，自由活動積極性顯著下降，在攝食及精神方面表現(xiàn)出了一定的衰老癥狀，與前期文獻報道一致［7-8］。

1.4 治療方法治療組大鼠于每日造模完成后予電針“百會”、“足三里”治療，取穴依據(jù)中國針灸學(xué)會實驗針灸學(xué)分會指定的《常用實驗動物穴位定位圖譜》。選擇0.25 mm×15 mm 一次性不銹鋼針灸針。于“百會”穴處向前平刺3～5 mm，“足三里”直刺約5 mm，接上HANS?100 A 型電針治療儀。一對導(dǎo)線分別接“百會”和“足三里”，左右側(cè)“足三里”交替使用。選用連續(xù)波，頻率50 Hz，電流1 mA，以穴位局部顫動為佳，留針20 min，每日1 次，共治療8 周。正常組和模型組同時段抓取固定20 min。

1.5 觀察指標與檢測方法

1.5.1 體質(zhì)量監(jiān)測每周測量體質(zhì)量。

1.5.2 Morris 水迷宮實驗定位航行實驗：實驗前將大鼠放入水池自由游泳2 min，以適應(yīng)水迷宮環(huán)境；平臺位于第4 象限中間，距離水面1 cm，將大鼠面向池壁分別從四個象限放入水中各一次，記錄其在120 s 內(nèi)找到隱藏在水面以下平臺的時間，記錄為逃避潛伏期，若120 s 內(nèi)未找到平臺者則將其引至平臺停留10 s，記錄逃避潛伏期為120 s，連續(xù)5 d?？臻g探索實驗：第6 天撤除平臺進行空間探索實驗，將大鼠從任選的非平臺象限入水點面向池壁放入水中，記錄120 s 內(nèi)跨越原平臺位置的次數(shù)。水迷宮實驗結(jié)束后處死大鼠，進行下述實驗。

1.5.3 Western blot加入蛋白裂解液提取各組大鼠海馬總蛋白；使用BCA 法測定各組蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度進行SDS?PAGE 電泳及轉(zhuǎn)膜，加入封閉液室溫封閉1 h；加入一抗4 ℃過夜；加入二抗；化學(xué)發(fā)光檢測，滴加ECL 混合溶液，曝光、顯影、定影、掃描，AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng)分析目標帶吸光度值。以目標帶的吸光度值與β?Actin 條帶吸光度值之比為TLR4、NF?κB P65 蛋白的相對表達量。

1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附測ELISA 法檢測大鼠海馬組織IL?1β、IL?6、TNF?α含量：取大鼠海馬組織勻漿上清液，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5.5 免疫熒光標記大鼠灌注固定后，迅速斷頭取腦放入4%多聚甲醛中固定48 h。隨后進行脫水、透明、浸蠟、組織包埋、石蠟切片機切片，常規(guī)脫蠟抗原修復(fù)后，PBS 沖洗5 min×3 次，滴加Iba?1一抗（1∶100），4 ℃過夜，PBS 沖洗5 min×3 次；滴加山羊抗兔IgG H&L（Cy3?）預(yù)吸附二抗，37 ℃暗盒孵育1 h，PBST 沖洗5 min×3 次；滴加DAPI 避光常溫孵育10 min，PBST 沖洗5 min×3 次，用含抗熒光淬滅劑的封片劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下采集圖片并統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用統(tǒng)計軟件GraphPad Prism 6 進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，繼以獨立樣本t檢驗比較兩組之間差異，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量比較造模結(jié)束后，模型組大鼠體質(zhì)量低于正常組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，電針干預(yù)使大鼠體質(zhì)量增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01，圖1）。說明電針能改善衰老引起的體質(zhì)量下降。

圖1 體質(zhì)量比較Fig.1 Comparison of weight

2.2 Morris 水迷宮測試結(jié)果比較水迷宮實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠平均逃避潛伏期延長，平臺穿越次數(shù)和在目標象限探索時間減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，電針干預(yù)能縮短大鼠平均逃避潛伏期，增加平臺穿越次數(shù)和在目標象限探索時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01），說明電針能改善AD 樣大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，見圖2-4。

2.3 各組大鼠海馬CA1 區(qū)活化小膠質(zhì)細胞數(shù)目的比較正常組大鼠海馬CA1 區(qū)Iba?1 陽性細胞胞體小，密度低，增大活化的細胞較少。模型組活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)目較正常組明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01）；治療組活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)目較模型組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05，圖5A、B）。

圖2 各組大鼠5 d 逃避潛伏期比較Fig.2 Comparison of 5?day escape latency of rats in each group

圖3 各組大鼠目標象限探索時間的比較Fig.3 Comparison of the target quadrant exploration time of rats in each group

圖4 各組大鼠跨越原平臺次數(shù)的比較Fig.4 Comparison of the times of crossing the original platform of rats in each group

圖5 海馬CA1 區(qū)活化的小膠質(zhì)細胞（免疫熒光染色，紅色熒光為Iba?1 標記的活化小膠質(zhì)細胞）Fig.5 Activated microglia in CA1 area of hippocampus（The activated microglia labeled with Iba?1 were stained by immunofluorescence）

2.4 海馬區(qū)TLR4、NF?κB P65蛋白表達的比較Western blot 檢測結(jié)果顯示，模型組TLR4 和NF?κB P65 蛋白表達水平顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；治療組蛋白表達水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，圖6）。

2.5 海馬區(qū)TNF?α、IL?1β、IL?6 含量的比較模型組大鼠海馬區(qū)炎癥因子TNF?α、IL?1β、IL?6 含量明顯高于正常組（P< 0.01）；治療組大鼠海馬區(qū)炎癥因子較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，圖7）。

3 討論

圖6 海馬區(qū)TLR4、NF?κB P65 蛋白表達水平的變化Fig.6 Changes of TLR4 and NF?κB p65 protein expression in hippocampus

神經(jīng)炎性反應(yīng)在AD 的病理進程中具有重要作用。研究表明，衰老會導(dǎo)致神經(jīng)炎癥反應(yīng)的持續(xù)增強，進而引起神經(jīng)細胞和組織生理功能的退化及結(jié)構(gòu)完整性的破壞，從而增加神經(jīng)退行性疾病的易感性［9］。因此于機體衰老的過程中進行早期干預(yù)控制炎癥反應(yīng)，或許對早期防治AD 具有重要意義。

學(xué)習(xí)記憶功能的喪失是AD 患者最主要的臨床癥狀之一。研究發(fā)現(xiàn)，電針能改善AD 模型大鼠認知功能障礙［10］。本實驗也發(fā)現(xiàn)，電針干預(yù)能縮短AD 樣大鼠水迷宮實驗平均逃避潛伏期，增加平臺穿越次數(shù)和在目標象限探索時間。由此可見，預(yù)針刺能提升AD 樣大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。

小膠質(zhì)細胞（MG）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有巨噬細胞。生理狀態(tài)下，MG 處于靜止?fàn)顟B(tài)，起免疫監(jiān)視作用。各種有害因素刺激下會迅速導(dǎo)致MG激活，轉(zhuǎn)變成阿米巴樣巨噬細胞狀態(tài)吞噬清除有害物質(zhì)［11-12］。然而炎癥刺激因素持續(xù)存在會導(dǎo)致MG 的長期慢性激活，形成炎癥反應(yīng)惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞壞死和認知功能障礙［13-14］。本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠海馬CA1 區(qū)MG 胞體增大，密度增加，活化的細胞較多，預(yù)針刺能抑制MG的活化，從而抑制神經(jīng)炎癥。

TLR4 是Toll 樣受體家族中重要的模式識別受體，主要分布在小膠質(zhì)細胞，能夠與刺激因素特異性結(jié)合，從而激活NF?κB，并促進其核轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致促炎細胞因子基因表達上調(diào)［15-16］。小膠質(zhì)細胞的長期慢性激活以及TLR4/NF?κB 信號通路已被證實與AD 的神經(jīng)炎性反應(yīng)及認知功能障礙密切相關(guān)。抑制TLR4/NF?κB 信號通路能夠改善AD 大鼠模型神經(jīng)炎性反應(yīng)及學(xué)習(xí)認知功能［17］。植物提取物如姜黃素、芹黃素等也能通過調(diào)節(jié)TLR4/NF?κB 信號通路從而減輕炎性反應(yīng)［18-19］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬組織中TLR4/NF?κB 信號通路相關(guān)蛋白及炎癥因子表達上調(diào)，預(yù)針刺能抑制TLR4/NF?κB 信號通路相關(guān)蛋白。由此可推斷，預(yù)針刺能改善AD 樣大鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)，其機制可能與抑制TLR4/NF?κB 信號通路有關(guān)。

中醫(yī)學(xué)強調(diào)“未病先防”，故本研究采用預(yù)針刺作為干預(yù)手段，以早期控制神經(jīng)炎癥反應(yīng)為切入點，體現(xiàn)了中醫(yī)“治未病”的獨到之處?！鞍贂?、“足三里”為臨床治療AD 的常用穴，現(xiàn)代研究表明，兩穴合用能改善AD 大鼠學(xué)習(xí)記憶認知功能，減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)［20］。

綜上所述，預(yù)針刺能改善AD 樣大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，其機制可能與抑制TLR4/NF?κB 信號通路有關(guān)。但是，本研究不能排除預(yù)針刺通過其他信號通路如NLRP3 炎癥小體信號通路發(fā)揮作用，也沒對星形膠質(zhì)細胞進行觀察，因此其具體作用機制當(dāng)進一步研究。