lncRNA KB?7G2.9在新發(fā)2型糖尿病患者血清中的表達及對胰島β細胞凋亡的影響

劉錚 王曄 施畢旻 孫麗麗 楊春梅

1蘇州大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科（江蘇蘇州215006）；2武漢大學人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（武漢430060）

糖尿病是人類主要慢性疾病之一，以慢性高血糖為特征的代謝異常綜合征［1-2］，嚴重威脅人們生命健康［3-4］。2 型糖尿病占糖尿病總數(shù)的95%［5-6］。胰島β細胞的凋亡是2 型糖尿病發(fā)病的重要機制［7］。探究胰島β細胞凋亡的分子機制，對糖尿病的防治研究可能具有重要的臨床意義。長鏈非編碼RNA（long?chain non?coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 個堿基的轉(zhuǎn)錄本，不能編碼蛋白［8-9］。近年研究［10-11］表明，lncRNA 可調(diào)控基因表達，影響細胞生命活動，參與糖尿病、高血壓、腫瘤等疾病的發(fā)生。lncRNA 可穩(wěn)定存在于血清，血清lncRNA在疾病診療過程中發(fā)揮生物標記物作用［12-13］。血清KB?7G2.9 是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在疾病特別是糖尿病中的作用及機制尚未見報道。本研究旨在檢測糖尿病患者血清中KB?7G2.9 的表達，分析血清KB?7G2.9 與2 型糖尿病患者胰島功能的相關(guān)性，探討KB?7G2.9 對胰島β細胞凋亡的作用及其機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取本院內(nèi)分泌科門診2019年1-11月就診的新發(fā)2 型糖尿病患者26 例為研究對象，其中男17 例，女9 例。選取本院2019年3-12月體檢中心的健康體檢者26 例為對照組，對所有對照體檢者進行糖耐量試驗，排除糖尿病患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 材料MIN6細胞購于上海生命科學院細胞所；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen 公司；質(zhì)粒購于上海吉瑪公司；WST?1 細胞增殖試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒購自美國Sigma 公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco 公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司；一抗購于英國Abcam 公司。

1.3 身高、體質(zhì)量及臨床血生化指標檢測所有研究對象均在空腹下測量身高、體質(zhì)量及采集靜脈血。體質(zhì)量指數(shù)（BMI）=體質(zhì)量/身高2。檢驗科檢測胰島素（FIN）、空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）等指標的水平。穩(wěn)態(tài)模型評估胰島β細胞功能指數(shù)（HOMA?β）=20×FIN/（FBG?3.5），F(xiàn)IN單位為μU/mL，F(xiàn)BG 單位為mmol/L。

1.4 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染MIN6 細胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件為37 ℃、5%CO2。將細胞根據(jù)隨機數(shù)字法分為陰性對照組和KB?7G2.9 組，根據(jù)Lipofectamine2000 說明書分別轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒和KB?7G2.9 過表達質(zhì)粒。

1.5 qRT?PCR 法提取血清或細胞總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR試劑盒擴增目的基因。KB?7G2.9 引物序列：上游5′?CCTTGCTCTTTAAGG?AAGTAGAGAGA?3′；下游5′?ATCCCGGATTGCTT?TCAAC?3′。GAPDH 引物序列：上游5′?TCCCATC?ACCATCTTCCA?3′，下游5′?CATCACGCCACAGTT?TCC?3′。PDCD5 引物序列：上游5′? GGCCCAACA?GGAAGCAAAG?3′；下游5′?GGCCGACTGATCCAG?AACTT?3′?；蛳鄬Ρ磉_量以2-ΔΔCt表示。

1.6 WST?1 法檢測細胞增殖能力將各組細胞消化和重懸，以3×103個/孔接種至96 孔板。每孔加入適量WST?1 試劑，酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度（OD）值，分別于接種后第1、2、3、4、5 天檢測。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率將各組細胞消化、收集，每組加5 μL Annexin V?FITC 染色液，室溫下避光孵育10 min，每組加10 μL PI 染色液，室溫下避光孵育6 min，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。

1.8 Western blot 檢測將各組細胞消化、收集，提取總蛋白。行SDS?PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉，在4 ℃下一抗孵育，次日孵育二抗，滴加ECL 發(fā)光顯影液，曝光顯影。

1.9 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差表示，正態(tài)分布資料采用兩獨立樣本t檢驗比較組間差異，兩變量之間的線性關(guān)系采用Pearson 相關(guān)性分析。以P< 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的臨床特征糖尿病患者和健康體檢者年齡、性別、身高、體質(zhì)量指標間的差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。與健康體檢者相比，糖尿病患者FIN 和HOMA?β均降低（均P< 0.01），F(xiàn)BG、HbA1c 均增加（均P<0.01）。見表1。

2.2 KB?7G2.9 表達與2 型糖尿病患者胰島功能的相關(guān)性與健康體檢者相比，2 型糖尿病患者血清中KB?7G2.9 表達增加（1.22±0.15vs.3.69±0.21，P<0.01），見圖1。Pearson 相關(guān)性分析顯示，KB?7G2.9 與FIN（r=-0.71，P< 0.01）、HOMA?β（r=-0.81，P<0.01）呈負相關(guān)，與HbA1c（r=0.79，P<0.01）呈正相關(guān)，見圖2。

2.3 qRT?PCR 檢測轉(zhuǎn)染效率與陰性對照組比較，KB?7G2.9 組KB?7G2.9 表達增加（1.03±0.14vs.12.91±1.26，P<0.01），表明轉(zhuǎn)染成功。

表1 糖尿病患者和同期體檢健康者的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of diabetic patients and healthy people ±s

表1 糖尿病患者和同期體檢健康者的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of diabetic patients and healthy people ±s

變量年齡（歲）性別（男/女）BMI（kg/m2）FIN（μU/mL）HOMA?β FBG（mmol/L）HbA1c（%）2 型糖尿病患者52.99±2.13 18/8 23.21±0.66 3.61±0.12 7.74±0.67 14.81±0.68 7.31±0.30體檢健康者48.47±2.18 15/11 22.96±0.82 5.34±0.21 21.43±1.14 5.27±0.23 4.11±0.22 P 值0.15 0.40 0.81<0.01<0.01<0.01<0.01

圖1 2 型糖尿病患者和體檢健康者血清KB?7G2.9 表達Fig.1 The expression level of serum KB?7G2.9 in patients with type 2 diabetes and healthy people

2.4 WST?1 法檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染KB?7G2.9 后細胞增殖能力下降（P<0.05），表明KB?7G2.9 可抑制MIN6 細胞增殖。見圖3。

圖2 KB?7G2.9 表達與FIN、HOMA?β、HbA1c 指標的Pearson 相關(guān)性分析Fig.2 Pearson correlation analysis of KB?7G2.9 expression and FIN，HOMA?β，HbA1c indicators respectively

圖3 WST?1 法檢測各組細胞增殖Fig.3 WST?1 method was used to detect the proliferation ability of cells in each group

2.5 流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細胞凋亡率與陰性對照組比較，KB?7G2.9 組細胞凋亡率增加［（9.33±2.07）%vs.（28.28±3.13）%，P<0.01］，KB?7G2.9 可促進MIN6 細胞凋亡。

2.6 qRT?PCR 檢測轉(zhuǎn)染后細胞PDCD5 mRNA 的表達與陰性對照組比較，KB?7G2.9 組細胞中PDCD5 mRNA 的表達較陰性對照組增加（1.03±0.13vs.9.31±1.26，P<0.01）。

2.7 Western blot 檢測Western blot 結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，KB?7G2.9 組程序性細胞死亡因子5（PDCD5）表達增加，細胞凋亡促進蛋白Bax 和Bad 表達增加，細胞凋亡抑制蛋白Bcl?2 和c?IAP1表達降低（圖4）。

3 討論

胰島β細胞凋亡導致胰島素分泌不足，是部分2 型糖尿病患者發(fā)病的重要機制［14］。lncRNA 既往被認為是轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物，不具有生物學功能［3，15-16］。近年研究［17-19］顯示，lncRNA 可調(diào)控基因的表達，廣泛參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。lncRNA 與糖尿病發(fā)生的不同階段均有相關(guān)性，特別是參與視網(wǎng)膜病變、心肌病、非酒精性脂肪性肝炎等糖尿病并發(fā)癥的調(diào)控［20-22］。lncRNA 在糖尿病中的研究有助于了解糖尿病的發(fā)生機制，lncRNA 已成為糖尿病生物標記物和靶向治療研究的重點。

圖4 Westen blot 檢測各組細胞靶基因的表達Fig.4 Westen blot was used to detect the expression of target gene proteins in each group

本研究首次發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病患者血清中KB?7G2.9 表達高于同期體檢健康者，表明KB?7G2.9 可能與糖尿病發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病患者KB?7G2.9 表達與FIN、HOMA?β呈明顯負相關(guān)，與HbA1c 呈明顯正相關(guān)，KB?7G2.9 表達增加可能與胰島β細胞功能降低有關(guān)。胰島β細胞凋亡導致胰島素分泌降低，是胰島β細胞功能降低的重要機制［23］。本研究通過將KB?7G2.9 過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MIN6 細胞，細胞增殖能力降低，細胞凋亡率增加，表明KB?7G2.9 可抑制MIN6 細胞增殖，加速細胞凋亡。PDCD5參與調(diào)控細胞的凋亡，通過抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，促進細胞的凋亡，PDCD5 高表達與糖尿病的發(fā)生相關(guān)［24-25］。qRT?PCR 檢測表明，過表達KB?7G2.9 后，PDCD5 mRNA 表達增加，表明KB?7G2.9 可促進PDCD5 基因的表達。Western blot顯示，PDCD5 蛋白表達增加后，細胞凋亡促進蛋白Bax 和Bad 表達增加，細胞凋亡抑制蛋白Bcl?2和c?IAP1 表達降低。上述結(jié)果顯示，KB?7G2.9可能通過上調(diào)PDCD5 基因表達，促進胰島β細胞系的凋亡。KB?7G2.9 調(diào)控PDCD5 的具體作用機制尚不明確，是下一步研究的重點。

綜上所述，血清KB?7G2.9 在2 型糖尿病患者中的表達高于體檢健康者，血清KB?7G2.9 與胰島β 細胞功能呈負相關(guān)，KB?7G2.9 可能通過促進PDCD5 基因表達，加速胰島β細胞凋亡。KB?7G2.9可能成為2 型糖尿病早期診斷和罹患風險評估的血清lncRNA 標志物。