細(xì)胞核受體RXRα在2,2′,4,4′-四溴二苯醚神經(jīng)毒性中的作用及其機(jī)制

許迎劍 ，張 航，張建清，

(1．山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)系，山西 太原 030001；2．深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 518055）

多溴二苯醚(polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)是一種用于多種工業(yè)產(chǎn)品的溴系阻燃劑，該類化合物的人體暴露負(fù)荷在全球范圍內(nèi)快速升高，嬰幼兒比成人有更高的暴露水平[1]。由于其對(duì)人體具有內(nèi)分泌干擾作用、生殖毒性、免疫毒性和神經(jīng)發(fā)育毒性，五溴和八溴聯(lián)苯醚已被《斯德哥爾摩公約》新增為需要消減和控制的持久性有機(jī)污染物黑名單[1]。目前的研究多集中于環(huán)境分布、污染特征及人體暴露等[2]，盡管有流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室研究表明，PBDEs 具有神經(jīng)發(fā)育毒性，但機(jī)制仍不清楚。在其209 種同系物中，2,2′,4,4′-四溴二苯醚(tetra-brominated diphenyl ethers，BDE-47)是人體組織中最重要、豐度最高、生物毒性也最強(qiáng)的單體之一，常作為代表性多溴二苯醚化合物，用于生物毒性效應(yīng)研究。

細(xì)胞核受體(nuclear receptor，NR)屬于配體激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在人體有48個(gè)家族成員，包括視黃醛X 受體(retinoid X receptors，RXRs)、甲狀腺激素受體(thyroid receptors，TRs)、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)等，在外源性化合物的生物毒性效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。特別是RXR作為細(xì)胞核內(nèi)公共異源二聚體的核心受體，是其他核受體激活的必需因子，可以調(diào)節(jié)包括膽固醇、脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)等許多基因，目前其作為代謝綜合征的藥物靶點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[3]。我們前期的研究也證明，BDE-47可以上調(diào)RXRα、TRs等細(xì)胞核受體的表達(dá)，但其相互作用機(jī)制不清。目前已有研究主要集中于單一核受體的表達(dá)變化所介導(dǎo)的甲狀腺毒性、內(nèi)分泌毒性效應(yīng)[4-6]，對(duì)多個(gè)核受體及其相互作用在神經(jīng)細(xì)胞毒效應(yīng)中的作用研究較少。

本研究通過構(gòu)建人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH的RXRα基因敲除細(xì)胞株及高表達(dá)細(xì)胞株，進(jìn)而分析比較這3 種細(xì)胞在BDE-47 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的差異，分析以RXRα為核心的TRα、TRβ、PPARα、PPARγ共4 種相關(guān)核受體的表達(dá)水平與差異，以揭示RXRs為核心的多個(gè)核受體在BDE-47導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞毒性中的相互作用，進(jìn)一步闡釋受體介導(dǎo)的PBDEs的神經(jīng)細(xì)胞毒性效應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞RXRα基因正常表達(dá)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(野生型SK-N-SH)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞RXRα基因敲除細(xì)胞株(RXR/KOSK-N-SH)和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞RXRα基因高表達(dá)細(xì)胞株(RXR/OE-SK-N-SH)在野生型SK-N-SH 基礎(chǔ)上構(gòu)建。

1.1.2主要試劑標(biāo)準(zhǔn)受試物BDE-47，純度≥98%，購(gòu)于Cambridge Isotope Laboratories，Inc公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗、PBS緩沖液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和0.25%胰蛋白酶均購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒CCK-8 購(gòu)于東仁化學(xué)科技有限公司；鼠抗人RXRα抗體、鼠抗人TRα1/α2 抗體、鼠抗人TRβ1 抗體、鼠抗人PPARα抗體、鼠抗人PPARγ抗體、HPR標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；Western blot及IP細(xì)胞裂解液和SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；分析級(jí)甲醇和分析級(jí)異丙醇購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠；RNeasy Mini Kit 購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司；Prime ScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)、TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus)和 Micro Amp?Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode 購(gòu)于大連寶生物工程公司；PCR 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器倒置生物顯微鏡，購(gòu)于重慶光學(xué)儀器廠；生物安全柜和CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于上海力申科學(xué)儀器公司；全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)于美國(guó)伯樂公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)于德國(guó)帝肯公司；微量核酸蛋白定量?jī)x和普通PCR擴(kuò)增儀購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；熒光定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)Stratagene 公司； 垂直電泳儀(Mini-PROTEAN Tetra)購(gòu)于美國(guó) BIO-RAD 公司；冷 CCD 成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)GE公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞RXRα基因敲除細(xì)胞株和高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建、培養(yǎng)和鑒定采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建RXRα基因干擾慢病毒載體，包裝慢病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)至野生型SK-N-SH 細(xì)胞，建立RXR/KO-SK-N-SH細(xì)胞系；利用PCR 擴(kuò)增法得到RXRα基因編碼區(qū)域片段，酶切連接慢病毒載體，包裝慢病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)至野生型SK-N-SH 細(xì)胞，建立RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞系。3種細(xì)胞，均傳代培養(yǎng)4～5代，并定期提取3種細(xì)胞總蛋白與RNA 采用Western blot 與PCR 方法檢測(cè)RXRα蛋白和mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行鑒定。待細(xì)胞增殖良好、RXRα基因表達(dá)穩(wěn)定時(shí)，備用。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖將受試細(xì)胞按1.0×105個(gè)/mL 的濃度均勻接種于 96 孔板，每孔 100 μL；設(shè)置空白組、溶劑對(duì)照組、BDE-47 處理組(濃度分別為1、5、10、20、50、100、150、200 μmol/L)，每組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期時(shí)，用BDE-47 按上述劑量濃度處理(DMSO 為0.2%)；均分別繼續(xù)培養(yǎng) 12、24、48、72 h 后，加入100 μL 新鮮培養(yǎng)基及10 μL CCK-8 共培養(yǎng)2 h，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處吸光度D(450)值。試驗(yàn)重復(fù)3次，按公式計(jì)算細(xì)胞活性抑制率。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RXRα、TRα、TRβ、PPARα、PPARγ的mRNA表達(dá)將受試細(xì)胞按照2.0×105個(gè)/mL 接種于6 孔板(每孔培養(yǎng)基總體積2 mL)，當(dāng)6孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)良好且處于對(duì)數(shù)期時(shí)，設(shè)置溶劑對(duì)照組(不含BDE-47，DMSO 為0.2%)，BDE-47 濃度分別為 5、10、20 μmol/L 處理細(xì)胞 24 h，之后用試劑盒提取細(xì)胞總RNA，微量核酸蛋白定量?jī)x確定RNA濃度與質(zhì)量，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR 儀擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，變性退火延伸進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，得到CT值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以管家基因GAPDH為內(nèi)參基因，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平2-ΔΔCT。

1.2.4 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) RXRα、TRα、TRβ、PPARα、PPARγ的蛋白表達(dá)按照上述步驟接種細(xì)胞于6 孔板，當(dāng)6 孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)良好且處于對(duì)數(shù)期時(shí)，設(shè)置溶劑對(duì)照組(不含BDE-47，DMSO為0.2%)，BDE-47濃度分別為5、10、20 μmol/L染毒細(xì)胞24 h， 提取細(xì)胞總蛋白， 二辛可寧酸(bicinchoninincacid，BCA)法進(jìn)行蛋白定量。首先組裝好玻璃板和支架，注入10%的SDS-PAGE 分離膠4 mL，并用異丙醇封面，待分離膠凝固后吸干膠面殘留液體后注入5%的濃縮膠1 mL，插上梳子待凝固后撥出梳子，每孔等量上樣20 μg后，恒定電壓80 V電泳30 min 后調(diào)節(jié)電壓至120 V 電泳55 min。然后將PVDF 膜用甲醇浸泡1 min，組裝濾紙板、PVDF 膜、凝膠、濾紙板“三明治”，以200 mA 的電流濕轉(zhuǎn)90 min。隨后用5%的脫脂奶粉配制TBST 封閉液，PVDF膜浸入封閉液常溫封閉1 h 或4 ℃過夜。RXRα、TRα、TRβ、PPARα、PPARγ、內(nèi)參(GAPDH)抗體的稀釋比例均為1∶1 000，在PVDF 膜上切取對(duì)應(yīng)分子大小的條帶浸入上述一抗稀釋液，冰上搖床過夜，孵育結(jié)束后用TBST洗膜3次，每次10 min；將目的條帶放入二抗稀釋液(1∶5 000)，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜3 次，每次10 min。將化學(xué)發(fā)光劑A 液和B 液等量混合，每個(gè)條帶消耗200 μL 發(fā)光液，將條帶平鋪在墊板上確保與墊板完全貼合沒有氣泡，將發(fā)光液均勻滴加在條帶表面，放入冷CCD 成像系統(tǒng)中曝光。ImageJ 2.0軟件分析目標(biāo)條帶光密度。實(shí)驗(yàn)分3批次提取細(xì)胞蛋白，每批次4個(gè)處理濃度并重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件分析，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析。均數(shù)間兩兩比較，當(dāng)方差不齊性時(shí)，選用秩和檢驗(yàn)；方差齊性時(shí)，選用Dunnett'st檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05(雙側(cè))。

2 結(jié) 果

2.1 RXR/KO-SK-N-SH 和 RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞株的構(gòu)建

圖 1 為 RXR/KO-SK-N-SH 和 RXR/OE-SK-N-SH細(xì)胞株的RXRα受體蛋白表達(dá)鑒定結(jié)果。RXR/KOSK-N-SH 細(xì)胞內(nèi)RXRα的蛋白表達(dá)水平約為野生型SK-N-SH 細(xì) 胞 的 1/5； RXR/OE-SK-N-SH 細(xì) 胞 內(nèi)RXRα的蛋白表達(dá)水平約為野生型SK-N-SH 細(xì)胞的2倍。表明 RXR/KO-SK-N-SH 和 RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均傳代4～5 次，且每批次細(xì)胞均檢測(cè)RXRα基因的表達(dá)水平，檢測(cè)結(jié)果顯示SKN-SH 細(xì)胞的RXRα敲除或者高表達(dá)細(xì)胞均穩(wěn)定傳代，以此確保所構(gòu)建的細(xì)胞適用于后續(xù)研究。

圖1 RXR/KO-SK-N-SH、野生型SK-N-SH 和RXR/OE-SK-NSH細(xì)胞內(nèi)RXRα蛋白相對(duì)表達(dá)水平

2.2 RXR/KO-SK-N-SH 和 RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞株對(duì)BDE-47增殖抑制毒性的敏感性比較

不同濃度BDE-47 分別處理上述3 種細(xì)胞12、24、48、72 h后細(xì)胞增殖結(jié)果見圖2。BDE-47對(duì)3種細(xì)胞均有明顯抑制作用，抑制率隨染毒濃度和染毒時(shí)間的增加而增加。

BDE-47 處理3 種細(xì)胞12～72 h，顯示細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率總體上隨BDE-47 濃度的增加而增加。另外，還觀察到3 種細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率在BDE-47 處理24 h 后變化均不明顯，均可達(dá)到半數(shù)抑制，故選24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理時(shí)間。由Probit 回歸模型統(tǒng)計(jì)分析得出，RXR/KO-SK-N-SH 細(xì)胞、野生型SK-N-SH 細(xì)胞和RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到50%時(shí)BDE-47 的染毒濃度即IC50分別是27、55 和54 μmol/L。在BDE-47的濃度和染毒時(shí)間均相同時(shí)，3種細(xì)胞相比，BDE-47 對(duì)RXR/KO-SK-N-SH 細(xì)胞的IC50是野生型和RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞1/2，說明RXR/KO-SK-N-SH細(xì)胞對(duì)BDE-47的增殖抑制作用更敏感。

圖2 BDE-47不同處理時(shí)間和濃度下的RXR狀態(tài)不同的3種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

3 種細(xì)胞在上述不同濃度BDE-47 染毒24 h 時(shí)的生長(zhǎng)抑制率變化擬合曲線方程見圖3。最高染毒計(jì)量是野生型SK-N-SH 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50%時(shí)濃度的1/3左右，以此確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)高、中、低劑量處理組的BDE-47濃度分別為20、10、5 μmol/L。

圖3 不同濃度的BDE-47染毒24 h時(shí)RXR受體狀態(tài)不同的3種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率變化的擬合曲線

2.3 BDE-47 對(duì)細(xì)胞核受體 RXRα、TRα、TRβ、PPARα、PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 BDE-47對(duì)3種細(xì)胞內(nèi)RXRα mRNA和蛋白表達(dá)的影響B(tài)DE-47 染毒3 種細(xì)胞后，RXRα的mRNA和蛋白表達(dá)水平見圖4。BDE-47未處理細(xì)胞時(shí)，野生型 SK-N-SH 和 RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞中 RXRα蛋白表達(dá)水平分別是RXR/KO-SK-N-SH 的7.75 倍和8.32倍，說明RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞和RXR/KO-SK-NSH細(xì)胞構(gòu)建成功。RXR/KO-SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)RXRα基因被敲除，RXRα mRNA 和蛋白幾乎不表達(dá)。按照BDE-47 低、中、高劑量組的順序，野生型SK-N-SH細(xì)胞和 RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞內(nèi) RXRα mRNA 表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BDE-47 中劑量處理組，野生型SK-N-SH 細(xì)胞和RXR/OE-SK-N-SH細(xì)胞RXRα蛋白表達(dá)明顯升高，分別是對(duì)照組的1.65和1.57倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3.2 BDE-47 對(duì) 3 種細(xì)胞內(nèi) TRα mRNA 和蛋白表達(dá)的影響B(tài)DE-47 處理3 種細(xì)胞后，TRα mRNA 和蛋白表達(dá)水平見圖5。RXR/KO-SK-N-SH 細(xì)胞中，TRα mRNA表達(dá)水平在低、中劑量組增加，分別是其對(duì)照組的1.16 和1.09 倍；TRα蛋白表達(dá)水平明顯降低。野生型SK-N-SH 和RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞中，TRα mRNA表達(dá)水平無明顯變化，蛋白表達(dá)水平在高劑量組明顯升高，分別是其對(duì)照組的1.33 和1.25 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 BDE-47對(duì)3種細(xì)胞內(nèi)RXRα mRNA和蛋白表達(dá)的影響

圖5 BDE-47對(duì)3種細(xì)胞內(nèi)TRα mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2.3.3 BDE-47 對(duì) 3 種細(xì)胞內(nèi) TRβ mRNA 和蛋白表達(dá)的影響B(tài)DE-47 處理3 種細(xì)胞后，TRβ mRNA 和蛋白表達(dá)水平見圖6。BDE-47按照低、中、高劑量組的順序，隨著劑量增加，3 種細(xì)胞與各自對(duì)照組相比較，TRβ mRNA 和蛋白表達(dá)水平均沒有明顯的變化。在同一劑量下，3 種細(xì)胞內(nèi)TRβ mRNA 和蛋白表達(dá)水平也無明顯差異。

圖6 BDE-47對(duì)3種細(xì)胞內(nèi)TRβ mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2.3.4 BDE-47 對(duì) 3 種細(xì)胞內(nèi) PPARα mRNA 和蛋白表達(dá)的影響B(tài)DE-47 處理3 種細(xì)胞后，PPARα mRNA 和蛋白表達(dá)水平見圖7。RXR/KO-SK-N-SH 細(xì)胞內(nèi)，PPARα mRNA表達(dá)水平無明顯變化，蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照組的70%、91%、69%，表達(dá)水平明顯降低。在BDE-47 高劑量組，野生型SK-N-SH 和RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞中PPARα mRNA 表達(dá)水平分別是對(duì)照組的1.13 和1.14 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照組的1.33 和1.21 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖7 BDE-47對(duì)3種細(xì)胞內(nèi)PPARα mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2.3.5 BDE-47 對(duì) 3 種細(xì)胞內(nèi) PPARγ mRNA 和蛋白表達(dá)的影響B(tài)DE-47 處理3 種細(xì)胞后，PPARγ的mRNA 和蛋白表達(dá)水平見圖8。RXR/KO-SK-N-SH 和野生型SK-N-SH 細(xì)胞中PPARγ mRNA 表達(dá)是分別是對(duì)照組的 99%、1.13、1.19 倍和 1.05、1.16、1.22 倍，蛋白表達(dá)是對(duì)照組的1.11 倍、95%、89%和92%、97%、74%；RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞內(nèi)，PPARγ的mRNA表達(dá)是對(duì)照組的1.09、1.07、1.22倍，蛋白表達(dá)是對(duì)照組的98%、1.10倍、76%。說明BDE-47處理3種細(xì)胞后，RXR/KO-SK-N-SH 和野生型SK-N-SH 細(xì)胞內(nèi)PPARγ mRNA 表達(dá)和蛋白表達(dá)水平均無明顯變化，RXR/OE-SK-N-SH細(xì)胞在高劑量組mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，而其蛋白表達(dá)水平無顯著變化。

圖8 BDE-47對(duì)3種細(xì)胞內(nèi)PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

BDE-47 作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，對(duì)生物體具有內(nèi)分泌干擾作用、器官毒性、生殖毒性、免疫毒性和神經(jīng)發(fā)育毒性[2，7]。在BDE-47 致肝癌細(xì)胞HepG2毒性的研究中發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激、DNA損傷和細(xì)胞周期異?？赡苁歉伟┘?xì)胞毒性效應(yīng)的機(jī)制[8]。在BDE-47致MCF-7細(xì)胞毒性效應(yīng)機(jī)制研究中，嘧啶、嘌呤、戊糖磷酸途徑代謝中相關(guān)代謝產(chǎn)物的表達(dá)顯著下調(diào)[9]。有報(bào)道顯示，大鼠產(chǎn)前暴露BDE-47 誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬缺陷導(dǎo)致甲狀腺組織損傷[10]。但關(guān)于受體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性效應(yīng)及機(jī)制的研究報(bào)道較少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，人SK-N-SH 細(xì)胞主要表達(dá)RXRα亞型，因此本研究構(gòu)建了RXRα基因敲除和高表達(dá)兩種不同的SK-N-SH細(xì)胞，旨在探討RXRs為核心的多個(gè)核受體在BDE-47 致神經(jīng)細(xì)胞毒性中的相互作用，以期揭示受體介導(dǎo)的PBDEs 神經(jīng)毒性效應(yīng)的分子機(jī)制。細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RXR/KO-SK-N-SH 細(xì)胞的IC50是野生型和RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞的1/2，說明RXR/KO-SK-N-SH 細(xì)胞對(duì)BDE-47 的毒性更敏感。因此，RXR在提高細(xì)胞生存能力中可能發(fā)揮重要作用。

體內(nèi)外研究表明，RXRα可以提高細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的能力。RXRα缺失的模型小鼠中GSH 合成明顯下調(diào)，而肝臟GSH 水平顯著降低。RXRα缺失的肝臟細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比，對(duì)三丁基過氧化氫(t-BHP)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激更加敏感[11]。還有研究也發(fā)現(xiàn)RXR與細(xì)胞增殖相關(guān)，胃癌組織中RXR的表達(dá)低于正常胃組織[12]。上述研究與本研究結(jié)果一致，說明RXRα可提高細(xì)胞的增殖，而其缺失會(huì)增加細(xì)胞對(duì)外源性化合物的敏感性，而RXRα在外源性化合物致毒性效應(yīng)中所發(fā)揮的作用可能是通過提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力實(shí)現(xiàn)的。

RXR是一類以同源二聚體存在或與其他核受體形成異二聚體的核受體，通過識(shí)別特異性反應(yīng)元件激活目的基因，并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而與其他核受體形成異源二聚體調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、分化和代謝，其在自身免疫和神經(jīng)退行性疾病的藥理靶向治療方面發(fā)揮重要作用[13-16]。異源二聚體與配體的相互作用方式?jīng)Q定了其被激活的配體，如RXR/TR二聚體只能被TR配體激活，而不能被RXR配體激活；RXR/PPAR 異二聚體可以被其中任意受體的配體激活[17]。甲狀腺激素受體(TRα和TRβ)可促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞增殖分化和調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞死亡等，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有著重要作用[18]。TRs 缺失或突變會(huì)導(dǎo)致甲狀腺功能減退、骨骼發(fā)育遲緩、運(yùn)動(dòng)障礙與認(rèn)知能力缺陷等[19]。有報(bào)道顯示配體化合物通過激活異聚體RXR而間接活化TR，實(shí)現(xiàn)TR/RXR協(xié)同干擾甲狀腺激素的分泌[20]。PPARα與PPARβ可促進(jìn)肝臟對(duì)脂肪的攝取與異生，從而增加肝臟脂肪的合成[21]。研究細(xì)胞膽固醇代謝、淀粉樣蛋白Aβ前體生成和轉(zhuǎn)移的過程時(shí)，RXR和PPARα激動(dòng)劑同時(shí)激活PPARα/RXR 二聚體，提示PPARα/RXR 二聚體在細(xì)胞膽固醇代謝過程中發(fā)揮重要作用[22]。PPARγ作為配體活化轉(zhuǎn)錄因子常與RXR異質(zhì)二聚化調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，維持成熟脂肪細(xì)胞的功能與存活、胰島素敏感度及脂肪和骨生成的平衡[23]。

因PPARs 和TRs 的活化前提是與RXRα形成異源二聚體，BDE-47作為RXR的配體，激活RXR之后再活化TRα、PPARα。在RXR/KO-SK-N-SH 細(xì)胞中，TRα mRNA表達(dá)水平升高，但是蛋白表達(dá)水平明顯降低；野生型SK-N-SH 和RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞中，mRNA 表達(dá)水平無明顯變化，蛋白表達(dá)水平在高劑量組明顯升高。在RXR/KO-SK-N-SH 細(xì)胞內(nèi)，PPARα的mRNA 表達(dá)水平無明顯變化，蛋白表達(dá)水平卻明顯降低；而高劑量BDE-47 處理的野生型SK-N-SH 和RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞中，PPARα的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)，BDE-47 可誘導(dǎo)野生型SK-N-SH 和RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞中TRα和PPARα的蛋白表達(dá)上調(diào)，而TRα在上述兩種細(xì)胞中的mRNA表達(dá)無明顯變化，由于mRNA 經(jīng)過修飾后翻譯合成蛋白質(zhì)，表觀遺傳修飾可調(diào)控基因表達(dá)從而影響蛋白翻譯，其mRNA 和蛋白水平的表達(dá)不一致可能與表觀遺傳修飾有關(guān)，這有待未來深入研究。上述兩個(gè)受體在RXR/KO-SK-N-SH 細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，同時(shí)在野生型SK-N-SH 和RXR/OE-SK-N-SH 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，說明RXRα可以介導(dǎo)TRα和PPARα的表達(dá)。同時(shí)，隨著BDE-47劑量的增加，TRβ和PPARγ在3種細(xì)胞中的表達(dá)均沒有明顯升高或者降低，說明BDE-47 并未激活或者抑制SK-N-SH 細(xì)胞TRβ和PPARγ表達(dá)，提示RXR沒有介導(dǎo)TRβ和PPARγ的表達(dá)。

綜上，RXRα在BDE-47 細(xì)胞毒性中發(fā)揮重要作用；BDE-47對(duì)人SK-N-SH 細(xì)胞的毒性效應(yīng)主要是通過激活RXRα，從而誘導(dǎo)TRα和PPARα表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。提示多溴二苯醚類化合物可能通過RXRα通路發(fā)揮其神經(jīng)內(nèi)分泌干擾毒性效應(yīng)。然而，以RXR為核心的多個(gè)細(xì)胞核受體之間的相互作用，有待進(jìn)一步深入研究。