核苷酸酶CD73在惡性腫瘤中作用和調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

戚玉竹，劉 靜，張國(guó)君

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院長(zhǎng)江學(xué)者實(shí)驗(yàn)室，廣東省乳腺癌診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041)

研究表明，核苷酸酶CD73 在多種人類(lèi)腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)[1]。但在不同腫瘤中，CD73 的作用方式和具體分子機(jī)制各有差異，因此，本文將圍繞CD73 在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及分子機(jī)制展開(kāi)論述，旨在為惡性腫瘤患者的個(gè)體化治療提供新的潛在治療方案。

1 核苷酸酶CD73

人CD73是由NT5E基因(位于6q14-21)編碼的523個(gè)氨基酸組成的多功能跨膜糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為70 000，其通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)錨定在細(xì)胞膜上[2]。研究發(fā)現(xiàn)，CD73廣泛表達(dá)于人體多種組織細(xì)胞表面，包括淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，控制多種生理作用，如上皮離子交換、液體轉(zhuǎn)運(yùn)、血小板功能、組織乏氧以及血管滲漏等[3]。

CD73蛋白由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N端結(jié)構(gòu)域(27-317AA)包含2 個(gè)鋅離子結(jié)合位點(diǎn)和至少1 個(gè)位于311 位天冬氨酸的N-糖基化位點(diǎn)；C 端結(jié)構(gòu)域(337-549AA)含有底物結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)GPI 錨定器非共價(jià)結(jié)合到質(zhì)膜上；N 端和C 端結(jié)構(gòu)域通過(guò)一個(gè)短螺旋(318-336AA)連接，其可控制酶的運(yùn)動(dòng)。因此，CD73存在“開(kāi)放”和“封閉”兩個(gè)構(gòu)象，而催化反應(yīng)需要CD73 從開(kāi)放構(gòu)象轉(zhuǎn)換為封閉構(gòu)象，后者可暴露活性結(jié)合位點(diǎn)，允許底物結(jié)合[4]。

2 CD73在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的分子機(jī)制

2.1 CD73水解酶功能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

CD73 是核苷酸酶，可水解細(xì)胞外5′-單磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)，使其去磷酸化生成腺苷，并通過(guò)腺苷能信號(hào)通路起作用，而5′-AMP 的離解常數(shù)和抑制常數(shù)通常在低濃度范圍內(nèi)(約50 μmol/L)[5]。在細(xì)胞中，CD39 和CD73 協(xié)同作用產(chǎn)生細(xì)胞外腺苷，即CD39 催化ATP 降解為AMP，CD73 進(jìn)而水解AMP 為腺苷。前一過(guò)程可在膜結(jié)合再生酶的作用下逆轉(zhuǎn)，而CD73水解AMP生成腺苷是不可逆的過(guò)程。

除AMP 外，CD73 還可催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)和煙酰胺單核苷酸，并降解為腺苷和煙酰胺核糖體，雖然該催化程度低于對(duì)AMP 的作用，但該發(fā)現(xiàn)提示了CD73 在NADH 代謝中的潛在新作用[6]。

CD73 的水解酶功能可影響腫瘤細(xì)胞的能量供給，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響是多方面的。

2.1.1 促進(jìn)細(xì)胞增殖Zhi 等[7]發(fā)現(xiàn)CD73 在乳腺癌組織中表達(dá)較高，且與惡性程度正相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 中過(guò) 表 達(dá) CD73 后 ，CD73 可 通 過(guò) 激 活 Akt/GSK-3β/β-catenin/cyclin D1信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖活性。反之，當(dāng)利用干擾技術(shù)在MB-MDA-231細(xì)胞中敲減CD73的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞在異種移植瘤實(shí)驗(yàn)中生長(zhǎng)速度均明顯降低，且晚期凋亡細(xì)胞比例顯著增加。

此外，在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CD73，其酶活性可促使細(xì)胞進(jìn)入S 期，G0/G1 期細(xì)胞比例減少，顯著增加細(xì)胞生存能力，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展。相反，抑制CD73 促進(jìn)細(xì)胞更多進(jìn)入G0/G1 期，S 期細(xì)胞比例減少。使用CD73 抑制劑α，βmethylene ADP(APCP)也有相似的周期抑制作用[7]。

2.1.2 介導(dǎo)免疫逃逸免疫逃逸也是惡性腫瘤在體內(nèi)迅速增殖的機(jī)制之一，為腫瘤的免疫治療提供了新的理論基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，CD73 可介導(dǎo)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞逃避。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)依賴的轉(zhuǎn)錄機(jī)制可促進(jìn)CD73+細(xì)胞在三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)的積聚；反之，抑制HIF 活性可阻斷化療誘導(dǎo)的CD73+細(xì)胞的富集，導(dǎo)致T細(xì)胞功能衰竭或死亡[8]。

此外，由于CD73 產(chǎn)生的游離腺苷可抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，提示CD73 可作為抑制性免疫檢查標(biāo)記物[9]。

2.1.3 參與腫瘤血管生成 血管生成對(duì)惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有重要的影響，是重要的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志。當(dāng)腫瘤細(xì)胞中CD73 的活性受到抑制時(shí)，腫瘤異種移植物的血管生成減少，提示該酶參與了腫瘤血管生成。CD73+/+肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMECs)較 CD73-/-的PMECs更容易形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)，且在腫瘤條件性培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)得更為明顯。同時(shí)，CD73 可降低內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)IV 型膠原的黏附，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。此外，裸鼠實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，CD73+/+腫瘤大小和血管生成程度均高于CD73-/-小鼠，提示腺苷可以刺激血管生成[10]。

2.1.4 腫瘤組織屏障功能 許多研究表明，CD73 可參與腫瘤組織屏障功能的控制。白細(xì)胞，特別是多形核白細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的成功轉(zhuǎn)移是通過(guò)局部連接間隙的擴(kuò)大和暫時(shí)的自變形來(lái)完成的[11]。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是使用APCP 還是抗CD73單克隆抗體1E9均可通過(guò)抑制CD73活性，進(jìn)而抑制其酶解產(chǎn)生腺苷及細(xì)胞外核苷酸代謝通路，可抑制高達(dá)85%的內(nèi)皮和上皮屏障的再密封功能。而中性粒細(xì)胞來(lái)源的AMP產(chǎn)生的腺苷通過(guò)激活腺苷A2B受體偶聯(lián)到細(xì)胞骨架的連接來(lái)增強(qiáng)屏障功能[12]。

2.1.5 產(chǎn)生耐藥性 Samanta 等[8]在研究中還發(fā)現(xiàn)，在TNBC 中化療藥物(卡鉑、阿霉素、吉西他濱或紫杉醇等)可通過(guò)調(diào)控HIF的活性，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄上調(diào)CD47、CD73 和PDL1 的表達(dá)，導(dǎo)致CD47+/CD73+/PDL1+乳腺癌細(xì)胞比例顯著升高，產(chǎn)生的腺苷使T細(xì)胞功能受損，抗腫瘤免疫功能下降。而Turcotte 等[13]。在FinHER 臨床試驗(yàn)中證實(shí)HER2基因擴(kuò)增的202例患者的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)低CD73水平(中位數(shù)以下)的乳腺癌患者曲妥珠單抗治療明顯獲益，而CD73水平高(中位數(shù)以上)的乳腺癌患者無(wú)顯著獲益。在乳腺癌細(xì)胞H2N100皮下移植瘤小鼠模型中，CD73過(guò)表達(dá)可明顯抑制抗erbb2 mAb 的活性。由此證明CD73 與HER2/ErbB2抗體治療耐藥有關(guān)

CD73 可通過(guò)直接的、細(xì)胞自主的代謝改變，介導(dǎo)腫瘤對(duì)鉑類(lèi)化療的敏感性。Peng 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CD73 可通過(guò)介導(dǎo)AKT/GSK-3β信號(hào)通路的活性促進(jìn)腎癌細(xì)胞對(duì)舒馬替尼耐藥的發(fā)生。CD73在乳腺癌細(xì)胞BT-549和MDA-MB-231中表達(dá)相對(duì)較高，而沉默CD73 可逆轉(zhuǎn)其對(duì)順鉑的敏感性。臨床樣本的研究中也發(fā)現(xiàn)，CD73 在獲得鉑類(lèi)抗性的細(xì)胞系中的表達(dá)高于敏感細(xì)胞系[15]。

2.2 CD73非水解酶功能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

研究發(fā)現(xiàn)，CD73 除了其酶解AMP 參與腺苷通路發(fā)揮的作用外，還可作為調(diào)節(jié)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分相互作用的信號(hào)和黏附分子，調(diào)控腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，具有重要的非水解酶

Airas等[16]利用單克隆抗體4G4識(shí)別功能，證實(shí)淋巴細(xì)胞血管黏附蛋白2(lymphocyte-vascular adhesion protein 2，L-VAP-2)和CD73是相同的糖蛋白，因此CD73作為黏附分子調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用。CD73 還可以下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，調(diào)節(jié)血管的通透性[6]。在黑色素瘤中，CD73可與Concanavalin a 相互作用導(dǎo)致脂質(zhì)筏與細(xì)胞骨架復(fù)合物的聯(lián)系增加。CD73 表達(dá)減少后，對(duì)Tenascin C層的黏附明顯減弱。提示CD73 除了酶解產(chǎn)生腺苷外，還可能在與細(xì)胞外基質(zhì)成分的黏附和相互作用中發(fā)揮獨(dú)立作用[17]。

另有研究顯示，腫瘤細(xì)胞中CD73 和表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，CD73 可調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞的EGFR 表達(dá)及其磷酸化，提示CD73可通過(guò)調(diào)控EGFR的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[18]。

3 惡性腫瘤中CD73表達(dá)調(diào)控機(jī)制

CD73的表達(dá)受多種因素調(diào)控，與HIF、IFN-α等因子密切相關(guān)。雌激素受體(estrogen receptor，ER)、Wnt/β-catenin 和SMAD 信號(hào)通路以及microRNA 可以直接參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控CD73 的表達(dá)，且CD73 的酶解產(chǎn)物腺苷可通過(guò)反饋調(diào)節(jié)影響其表達(dá)。此外，化學(xué)物質(zhì)也可影響CD73的表達(dá)水平。

眾所周知，腫瘤組織內(nèi)普遍缺氧，而缺氧條件可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生HIF 二聚體，后者可與CD73基因啟動(dòng)子中乏氧反應(yīng)元件(hypoxia-responsive elements，HRE)直接結(jié)合，從而促進(jìn)CD73的轉(zhuǎn)錄[19]。

而干擾素IFN-α則可通過(guò)誘導(dǎo)其他調(diào)控介質(zhì)間接促進(jìn)CD73基因轉(zhuǎn)錄。在膀胱癌模型中，IFN-α膀胱灌注后，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生CD73，且呈時(shí)間和劑量依賴性，在體內(nèi)血管系統(tǒng)中CD73的上調(diào)顯著增加CD73介導(dǎo)的腺苷的產(chǎn)生，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性降低，提示IFN-α是CD73 的體內(nèi)調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)CD73依賴性的腺苷產(chǎn)生，進(jìn)而控制其誘導(dǎo)炎癥的程度[20]。

通過(guò)對(duì)體內(nèi)信號(hào)通路的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)ER 負(fù)調(diào)控CD73 的表達(dá)，ER 的缺失可顯著增強(qiáng)了CD73 的表達(dá)。雌二醇與ER 結(jié)合后，ER 入核與CD73基因啟動(dòng)子Sp-1和Ap-2 結(jié)合位點(diǎn)，下調(diào)CD73基因的表達(dá)[21]。染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)錄因子SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5 和SP1可與CD73啟動(dòng)子結(jié)合，提示人類(lèi)CD73的表達(dá)可能受到SMAD轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[22]。

值 得 注 意 的 是 ， CD73 的 3′非 翻 譯 區(qū) (3′-untranslated region，3′-UTR)包含1 774個(gè)核苷酸，超過(guò)了人類(lèi)3′-UTR平均長(zhǎng)度約3 倍[23]，因此，microRNA 對(duì)CD73 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控尤為重要，現(xiàn)已報(bào)道m(xù)iR-30s、miR-187、miR-193b、miR-340及miR-422a等可直接靶向CD73 mRNA并抑制其表達(dá)[24-25]。

有趣的是，CD73 的產(chǎn)物腺苷可通過(guò)激活瘤細(xì)胞表面腺苷受體，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，而cAMP與CD73基因啟動(dòng)子中的cAMP應(yīng)答元件(cAMP response element，CRE)直接結(jié)合，進(jìn)而正反饋性上調(diào)CD73基因的轉(zhuǎn)錄[26]。此外，Yang等[27]通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)硫木林富馬酸氫(tiamulin，THF)通過(guò)降低CD73 的活性，而非CD73 的表達(dá)來(lái)抑制其作用，顯著抑制乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

4 以CD73為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療潛能

Zhi 等[7]利用siRNA 干擾技術(shù)使CD73 功能缺失，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與基質(zhì)的黏附能力、生長(zhǎng)和侵襲能力顯著降低。目前研究提示單抗和化學(xué)藥物等靶向CD73 的多種應(yīng)用在腫瘤干預(yù)中發(fā)揮重要作用。

免疫療法是一種新興的干預(yù)手段，通過(guò)直接刺激排斥類(lèi)型的過(guò)程或阻斷抑制途徑，改變患者的免疫系統(tǒng)以對(duì)抗癌癥。在人類(lèi)免疫系統(tǒng)中，CD73廣泛表達(dá)于T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群、生發(fā)中心濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞、胸腺髓質(zhì)網(wǎng)狀成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。研究表明，抗CD73單克隆抗體導(dǎo)致CD73細(xì)胞表面聚集，繼而發(fā)生內(nèi)化，從而抑制循環(huán)腫瘤細(xì)胞的外滲和定殖能力，進(jìn)而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[28]。因此由核苷酸酶CD73產(chǎn)生的細(xì)胞外腺苷可作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的干擾抗腫瘤免疫反應(yīng)的“免疫檢查點(diǎn)”。Stagg等[29]在免疫健全的小鼠模型中，用抗CD73單抗成功阻斷了乳腺癌細(xì)胞CD73 的功能，顯著降低腫瘤生長(zhǎng)速度和自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的能力，但在免疫缺陷的小鼠模型中，單抗治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)速度無(wú)影響，提示抗CD73 單抗的抗腫瘤作用需要機(jī)體適當(dāng)?shù)拿庖吡榛A(chǔ)，而抗CD73的單克隆抗體還可以增強(qiáng)多克隆NK細(xì)胞對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的溶解活性。

CD73 的抑制劑APCP 可選擇性抑制CD73 的生物活性，控制胞外腺苷的濃度以及調(diào)節(jié)其受體的活性，調(diào)節(jié)腺苷的生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Antonioli等[30]在小鼠黑色素瘤模型中，研究APCP聯(lián)合抗細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyteassociated antigen 4，CTLA-4)的單克隆抗體的聯(lián)合作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APCP可增強(qiáng)抗CTLA-4單抗的活性，阻斷調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)揮功能中其關(guān)鍵作用的腺苷A2A受體，顯著抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，效果明顯優(yōu)于兩者的單獨(dú)治療效果。另外，CD73 可促進(jìn)體內(nèi)有B16F10 黑色素瘤細(xì)胞的C57BL/6小鼠的新生血管形成，而抑制CD73可降低新生血管的數(shù)量并阻礙新生血管的成熟，從而減弱黑色素瘤的血管生成。

綜上所述，利用CD73 單克隆抗體、小干擾RNA 技術(shù)、CD73 抑制劑，均可顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為抗腫瘤治療提供了新途徑。

5 展 望

研究表明，CD73 在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程有著重要作用，且CD73 的過(guò)表達(dá)與不同類(lèi)型腫瘤患者的治療療效差和不良生存預(yù)后密切相關(guān)，提示CD73 有可能成為預(yù)測(cè)惡性腫瘤患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。通過(guò)單抗及化學(xué)方法抑制CD73 后，小鼠異體移植模型中腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移得到抑制，抗CD73 治療與抗其他靶點(diǎn)單抗的聯(lián)合抗腫瘤效果更加明顯。目前，抗CD73 治療在小鼠模型的研究中并未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。由于CD73在生物體內(nèi)的功能極其復(fù)雜，靶向CD73的新型治療模式必須對(duì)其可能會(huì)出現(xiàn)的不良反應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格論證才能應(yīng)用于臨床。未來(lái)，更多的研究將致力于完整深入地闡述調(diào)控CD73 的酶活性及其參與的腺苷通路的理論，和進(jìn)一步發(fā)掘CD73基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。由此可以設(shè)計(jì)針對(duì)性的干預(yù)對(duì)策，從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和酶活性調(diào)節(jié)來(lái)抑制CD73 的功能，使之成為多種惡性腫瘤藥物治療的重要靶點(diǎn)。