生物標(biāo)志物的聯(lián)合檢測對(duì)矽肺早期輔助診斷的價(jià)值

徐海明，劉科良，郝艷星，汪 嶺，劉志宏，德小明

(寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，寧夏 銀川 750004)

矽肺是在生產(chǎn)過程中長期吸入游離二氧化硅(SiO2)粉塵而引起的以硅結(jié)節(jié)形成及彌漫性肺間質(zhì)纖維化為主要病變的職業(yè)病，是塵肺中進(jìn)展最快、危害最嚴(yán)重的一種[1-2]。目前，對(duì)矽肺的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制并不十分清楚，公認(rèn)的矽肺發(fā)病機(jī)制有機(jī)械刺激學(xué)說、化學(xué)中毒學(xué)說、硅酸聚合學(xué)說和免疫學(xué)說等[3-4]。眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)細(xì)胞釋放的多種生物活性物質(zhì)尤其是細(xì)胞因子在矽肺的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[5]。

多項(xiàng)研究表明，多種因子的聯(lián)合診斷效能優(yōu)于單個(gè)因子的診斷效能[6-8]。因此，本研究同時(shí)測定了與矽肺發(fā)生發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)的多個(gè)指標(biāo)，包括氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。隨后，在統(tǒng)計(jì)分析的基礎(chǔ)上，繪制受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve，ROC)，并建立Logistic 回歸模型，探討聯(lián)合檢測多個(gè)指標(biāo)應(yīng)用于矽肺早期輔助診斷的靈敏度和特異性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

采用立意抽樣法，選取在寧夏某職業(yè)病防治醫(yī)院接受治療的 65 例矽肺患者(矽肺 I 期 43 例，II 期 22 例)為病例組，以長期吸入游離SiO2粉塵的70例在崗作業(yè)人員為對(duì)照組，對(duì)照組均未被診斷為矽肺。診斷標(biāo)準(zhǔn)為《GBZ 70-2015 職業(yè)性塵肺病的診斷》。研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①均有確切的粉塵接觸史和職業(yè)史；②矽肺患者無罹患除矽肺外的重大肺部疾??；③對(duì)照組作業(yè)人員無罹患重大肺部疾病。本研究得到了寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并獲得所有研究對(duì)象的知情同意。

1.2 血樣采集

用分離膠/促凝劑真空采血管采集空腹靜脈血5 mL，待血清充分分離后，將血清轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，立即放入-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SOD、MDA、IL-6及TNF-α水平的測定

使用SOD 和MDA 比色試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)測定研究對(duì)象血清中SOD 和MDA 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，SOD和MDA的測定波長分別為405 和532 nm(A6 半自動(dòng)生化儀，北京松上公司)。使用IL-6 和TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)測定研究對(duì)象血清中IL-6 和TNF-α水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，IL-6和TNF-α的測定波長均為450 nm(STAX FAX 2100 全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀，美國Awareness Technology 公司)。使用Bradford 蛋白質(zhì)定量試劑盒測定研究對(duì)象血清中總蛋白水平(北京天根生化科技有限公司)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件，計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布者采用xˉ±s描述，不符合正態(tài)分布者采用中位數(shù)和第25、75百分位數(shù)[M(P25，P75)]描述。均數(shù)比較采用協(xié)方差分析，百分位數(shù)比較采用Mann WhitneyU檢驗(yàn)。采用GraphPad Prism 5 軟件制作ROC曲線。用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的血清生物標(biāo)志物建立聯(lián)合應(yīng)用模型，采用二分類Logistic回歸模型逐步回歸法(引入臨界值0.05，剔除臨界值0.1)對(duì)聯(lián)合應(yīng)用診斷的效能進(jìn)行評(píng)估。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

對(duì)照組的平均年齡和工齡分別為(42.64±5.81)歲與(22.93±6.36) a，矽肺I 期的平均年齡和工齡分別為(47.06±4.31)歲與(26.05±4.50) a，矽肺II期的平均年齡和工齡分別為(51.30±4.53)歲與(29.96±5.13) a，各組間研究對(duì)象的平均年齡和工齡差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，將年齡及工齡作為協(xié)變量，采用協(xié)方差分析，將各組指標(biāo)進(jìn)行比較，以消除上述因素對(duì)檢測結(jié)果的影響。

2.2 矽肺患者血清中SOD及MDA水平的變化

各組人群血清中SOD 和MDA 水平的比較見表1。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，矽肺患者血清中SOD水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；矽肺I期及II期患者的血清中MDA 水平分別升高36.62%和33.40%，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。

表1 各組人群血清中SOD和MDA水平的比較

2.3 矽肺患者血清中IL-6及TNF-a水平的變化

各組人群血清中IL-6 和TNF-α水平的比較見表2。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，矽肺I期及II期患者的血清中IL-6 水平分別升高27.71%和25.25%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；矽肺I期患者血清中TNF-α水平升高12.37%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組人群血清中IL-6和TNF-α水平的比較

2.4 ROC曲線分析

為了評(píng)價(jià)各生物標(biāo)志物對(duì)矽肺早期的診斷價(jià)值，我們?nèi)?duì)照組和矽肺I 期組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的3個(gè)指標(biāo)繪制了ROC 曲線進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，曲線下面積(area under the curve，AUC)分別為IL-6(0.86)＞MDA(0.81)＞TNF-α(0.65)，IL-6 與 MDA 的靈敏度和特異性相對(duì)較好(表3)。

表3 IL-6、TNF-α及MDA對(duì)矽肺早期輔助診斷的ROC分析

2.5 用于矽肺早期輔助診斷的多個(gè)生物標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用模型

采用二分類Logistic回歸模型，評(píng)估對(duì)照組和矽肺I 期組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的3 個(gè)血清生物標(biāo)志物在兩組樣本中診斷的效能，建立矽肺和正常人群中診斷矽肺的Logistic 回歸模型：P=-10.21+0.05×CIL-6-0.02×CTNF-α+0.72×CMDA，得到 3 個(gè)生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測的AUC為0.89(95%CI：0.84～0.94，P＜0.01)。分析結(jié)果顯示，這3 個(gè)生物標(biāo)志物的聯(lián)合應(yīng)用模型其診斷效能優(yōu)于單個(gè)生物標(biāo)志物的診斷效能。

3 討 論

矽肺是由于長期吸入游離SiO2粉塵所引起的職業(yè)病。研究發(fā)現(xiàn)SiO2有較強(qiáng)的致纖維化作用，SiO2顆?？纱龠M(jìn)巨噬細(xì)胞持續(xù)釋放炎性細(xì)胞因子，刺激成纖維細(xì)胞增殖和促進(jìn)膠原纖維合成產(chǎn)生纖維化[9-10]。若臨床早期能夠?qū)@些細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，將對(duì)矽肺早期監(jiān)測具有重要意義。

在矽肺的發(fā)生中，SiO2粉塵作用于肺泡，大量氧自由基生成，這些自由基可作用于膜的不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。MDA是膜脂質(zhì)過氧化分解的產(chǎn)物，本研究結(jié)果顯示，矽肺患者血清中MDA水平高于對(duì)照組(P＜0.05)，這和王素華等[11]的研究結(jié)果一致。IL-6 和TNF-α具有明顯的致纖維化作用[12]。IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子處于炎癥瀑布反應(yīng)的中心位置，被稱為促炎癥細(xì)胞因子(pro-inflammatory cytokines)。在發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，炎癥因子釋放增加，炎癥因子的過度產(chǎn)生是導(dǎo)致組織損傷的主要原因[13-14]。本次研究中矽肺患者血清中IL-6 水平高于對(duì)照組(P＜0.05)，與以往的研究結(jié)果一致。肺泡巨噬細(xì)胞被激活后會(huì)釋放一種前炎性介質(zhì)TNF-α，該因子在塵肺早期炎癥反應(yīng)乃至最終塵肺纖維化發(fā)生過程中起著重要作用。以往研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在血清的表達(dá)水平爭議較大，有學(xué)者認(rèn)為TNF-α在吸入粉塵后異常增多，從而引起體內(nèi)細(xì)胞因子之間相互協(xié)調(diào)、制約作用的紊亂，最終引起塵肺的發(fā)生發(fā)展；也有學(xué)者認(rèn)為塵肺患者Th1 細(xì)胞活化數(shù)量較少或功能減弱，而Th1 細(xì)胞以產(chǎn)生TNF-α為主，IL-6 則由Th2 細(xì)胞分泌，所以導(dǎo)致塵肺患者血清中TNF-α表達(dá)量降低[15]。但是大多數(shù)研究者認(rèn)為塵肺早期為炎癥反應(yīng)，以Th1 細(xì)胞反應(yīng)為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，中晚期以Th2 為主的體液免疫應(yīng)答，TNF-α表達(dá)水平會(huì)升高[16]，與本研究結(jié)果一致。

此外，在本研究中，就MDA、IL-6及TNF-α水平而言，矽肺I 期和II 期測定結(jié)果差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者認(rèn)為，主要原因有兩點(diǎn)：第一，這些指標(biāo)并非反映矽肺發(fā)生發(fā)展的特異性指標(biāo)；第二，本研究納入矽肺I 期43例，II 期病例22例，測定結(jié)果表現(xiàn)出較大的個(gè)體差異性。下一步，應(yīng)當(dāng)增加納入的病例數(shù)，進(jìn)一步研究上述指標(biāo)在矽肺不同分期病例血清中的變化趨勢。

盡管本研究發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF-α和MDA在對(duì)照組和矽肺患者血清中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是僅僅采用血清中的一種生物標(biāo)志物作為矽肺的標(biāo)志物往往缺乏特異性，若將多種生物標(biāo)志物組合有可能提高診斷的準(zhǔn)確性。本研究通過對(duì)在對(duì)照組和矽肺I 期患者表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物標(biāo)志物繪制ROC曲線進(jìn)行分析，診斷靈敏度為65.2%～86.4%。而將這3 個(gè)生物標(biāo)志物組合，建立診斷矽肺的Logistic回歸模型，則可使診斷靈敏度達(dá)到89.3%。IL-6、TNF-α和MDA 的聯(lián)合應(yīng)用檢測可以提高矽肺早期輔助診斷的靈敏度和特異性。下一步，可納入更多層面的指標(biāo)，進(jìn)一步探討多指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用檢測方法對(duì)矽肺早期輔助診斷的價(jià)值。