基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的二仙湯治療抑郁癥的作用機(jī)制研究

羅武龍，陳 潔，牛 婕，李 玲，曾寧溪，嚴(yán) 燦，吳麗麗

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究中心,廣東 廣州 510006)

抑郁癥是一種情感障礙疾病，可以由多種因素引起，高發(fā)病率和高致殘率是其特點(diǎn)。在抑郁癥的藥物治療中，存在治愈率低、復(fù)發(fā)率高等突出問題。二仙湯是中醫(yī)經(jīng)典名方，方中仙茅、仙靈脾可以溫腎陽，補(bǔ)腎精；黃柏、知母滋腎陰，瀉腎火；當(dāng)歸溫潤(rùn)養(yǎng)血，調(diào)理沖任。已有研究證實(shí)，二仙湯及其加減對(duì)抑郁癥具有明顯的改善作用[1-2]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種以系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)，通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索及計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”間網(wǎng)絡(luò)，用于探討藥物對(duì)疾病作用機(jī)制的生物信息學(xué)新研究方法[3]。中醫(yī)學(xué)理論體系的基本特點(diǎn)為整體觀和辨證論治，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)性、整體性有異曲同工之妙。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能有效推動(dòng)中藥復(fù)方的深入研究，揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制。分子對(duì)接是基于受體和配體的空間結(jié)構(gòu)的對(duì)接，能快速預(yù)測(cè)中藥成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合力。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接相結(jié)合的方法，探討二仙湯抗抑郁的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

研究流程見Fig 1。

Fig 1 Research process of depression resistance of Erxian decoction

1.1 二仙湯中化學(xué)成分的獲取在中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析系統(tǒng)平臺(tái)中搜索，結(jié)合文獻(xiàn)檢索，篩選二仙湯中仙靈脾、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母的所有化學(xué)成分。

1.2 口服生物利用度和類藥性篩選中藥多為口服制劑，到達(dá)靶標(biāo)器官、組織發(fā)揮作用，需要經(jīng)過吸收、分布、代謝、排泄，即ADME過程。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫以閾值OB≥30%，DL≥0.18(中藥ADME的核心參數(shù)是口服生物利用度，OB；類藥性，DL)篩選出符合條件的活性成分。當(dāng)歸中一些具有高含量和高生物活性，但不全部滿足這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的化合物，因文獻(xiàn)報(bào)道其具有顯著的藥理學(xué)作用，故也將其作為當(dāng)歸的活性成分予以保存[4]。

1.3 二仙湯潛在靶點(diǎn)挖掘基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，將仙靈脾、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母中的活性成分與潛在靶點(diǎn)逐個(gè)配對(duì)，通過UniProt數(shù)據(jù)庫中的UniProtKB功能，限定物種為“human”，輸入蛋白名稱，得到靶點(diǎn)蛋白的官方名稱(official gene symbol)，即為二仙湯活性成分的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)獲取在基因疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫DisGeNET(http://www.disgenet.org/home/)以關(guān)鍵詞“mental depression”進(jìn)行檢索，得到抑郁癥的治療靶點(diǎn)。

1.5 二仙湯與抑郁癥PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用信息。利用獲得的預(yù)測(cè)信息，將二仙湯靶點(diǎn)映射到抑郁癥已知的治療靶點(diǎn)的靶點(diǎn)上，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，并利用可視化軟件Cytoscape 3.6.0的“Network Analyzer”插件以節(jié)點(diǎn)度值(Degree)、中心性(Closeness Centrality)為拓?fù)渲笜?biāo)對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)(node)之間若存在調(diào)控作用關(guān)系則以邊(edge)相連。Degree和Closeness Centrality常用于說明網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的重要性，其值越大，說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要，對(duì)該網(wǎng)絡(luò)起主要調(diào)控作用的核心靶點(diǎn)以大于Degree中位數(shù)的2倍和大于Closeness Centrality中位數(shù)作為拓?fù)渲笜?biāo)進(jìn)行拓?fù)浞治龊Y選。

1.6 GO生物學(xué)過程和KEGG信號(hào)通路分析利用DAVID(http://david.nifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對(duì)拓?fù)浞治龊蟮暮诵陌悬c(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)過程分析和KEGG通路分析，首先以P值作為篩選指標(biāo)，選取P<0.01的條目，結(jié)合文獻(xiàn)閱讀篩選與抑郁癥密切相關(guān)的通路，得到核心靶點(diǎn)參與的關(guān)鍵通路信息，將二仙湯對(duì)應(yīng)的靶蛋白直接映射到通路上，選取既包含藥物靶點(diǎn)又包含疾病靶點(diǎn)的通路。

1.7 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為了更清晰的展現(xiàn)復(fù)方成分、核心靶點(diǎn)與通路之前的關(guān)系，將通路上所含有的活性成分及靶點(diǎn)，利用Cytoscape3.6.0軟件構(gòu)建二仙湯活性成分-靶點(diǎn)-通路圖。在該網(wǎng)絡(luò)中，活性成分、核心靶點(diǎn)或通路以節(jié)點(diǎn)表示；活性成分、靶點(diǎn)及作用通路之間的關(guān)系以邊表示。

1.8 分子對(duì)接驗(yàn)證分子對(duì)接可以調(diào)整受體化合物的的位置、構(gòu)像等，將三維結(jié)構(gòu)已知的分子依次放于靶標(biāo)分子的活性位點(diǎn)處，尋找小分子化合物與靶蛋白的最佳結(jié)合體。其結(jié)果可顯示中藥活性成分與重要靶蛋白之間的結(jié)合活性, 對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理的分析結(jié)果起到一定的驗(yàn)證作用。

利用Uniport檢索靶點(diǎn)，選擇高分辨率的PDBID，化合物的3D結(jié)構(gòu)文件可在PubChem中下載，運(yùn)用SystemsDock進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。PTGS2是“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中Degree值最大的靶點(diǎn)，將其與對(duì)應(yīng)的部分活性成分及通路中二仙湯和抑郁癥共有靶點(diǎn)中Degree排名最靠前的兩個(gè)靶點(diǎn)AKT1和MAPK1與各自對(duì)應(yīng)的部分活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 二仙湯中活性成分及潛在靶點(diǎn)篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索，二仙湯中仙靈脾得到化學(xué)成分130種，仙茅78種，巴戟天174種，當(dāng)歸135種，黃柏140種，知母81種；根據(jù)口服生物利用度和類藥性分析并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，二仙湯共篩選出77個(gè)主要活性成分，其中仙靈脾23種、仙茅7種、巴戟天18種、當(dāng)歸16種、黃柏37種、知母15種。值得注意的是，谷甾醇(stigmasterol)是黃柏、知母、仙茅、當(dāng)歸的共有活性成分，β-谷甾醇(beta-sitosterol)是巴戟天、仙茅、當(dāng)歸的共有活性成分，槲皮素(quercetin)是黃柏和仙靈脾的共有活性成分，山柰酚(kaempferol)是仙靈脾和知母的共有活性成分。將篩選得到的活性成分基于TCMSP逐一配對(duì)潛在靶點(diǎn)，得到二仙湯的潛在靶點(diǎn)。其中黃柏有225個(gè)靶點(diǎn)，當(dāng)歸有94個(gè)靶點(diǎn)，巴戟天有60個(gè)靶點(diǎn)，仙靈脾有256個(gè)靶點(diǎn)，仙茅有55個(gè)靶點(diǎn)，知母有118個(gè)靶點(diǎn)，重復(fù)靶點(diǎn)僅保留1個(gè)，二仙湯共有268個(gè)潛在靶點(diǎn)。

2.2 精神抑郁的治療靶點(diǎn)獲取在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中共檢索獲得574個(gè)精神抑郁的已知治療靶點(diǎn)。

2.3 靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)分析基于String數(shù)據(jù)庫得到二仙湯268靶點(diǎn)和精神抑郁574靶點(diǎn)的蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)，共有713個(gè)節(jié)點(diǎn)和17 043條蛋白互作關(guān)系。將該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中Degree中位值的兩倍即70，Closeness Centrality的中位數(shù)即0.499作為拓?fù)渲笜?biāo)篩選，最后得到90個(gè)靶點(diǎn)，作為二仙湯發(fā)揮抗抑郁作用的核心靶點(diǎn)。這90個(gè)靶點(diǎn)包括52個(gè)來源于二仙湯的靶點(diǎn)，68個(gè)來源于精神抑郁的已知治療靶點(diǎn)，以及30個(gè)共同來源的靶點(diǎn)。

2.4 GO生物過程和KEGG代謝通路富集分析將拓?fù)浞治龅玫降?0個(gè)靶點(diǎn)映射到GO生物學(xué)過程和KEGG通路上，GO生物學(xué)過程共得到644條，以P<0.01為篩選指標(biāo)，選區(qū)與抑郁癥相關(guān)的條目，共53條，主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、ERK1的正調(diào)控、調(diào)節(jié)血壓、凋亡調(diào)控等，見Fig 2。KEGG共篩選得到127條通路，首先，以P<0.01為篩選指標(biāo)，得到通路106條；其次，結(jié)合已知抑郁癥病理機(jī)制及文獻(xiàn)報(bào)道，選出與抑郁癥密切相關(guān)的24條通路。在這24條通路中，包括與凋亡相關(guān)的7條通路:Ras信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等；與突觸可塑性相關(guān)的8條通路：多巴胺能神經(jīng)突觸、ERBB信號(hào)通路等；3條與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的通路:cAMP信號(hào)通路和VEGF信號(hào)通路;6條與炎癥免疫相關(guān)的通路:腫瘤壞死因子信號(hào)通路和細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路等, 見Tab 1。

Tab 1 KEGG pathway analysis of potential targets of Erxian decoction in treatment of depression

Fig 2 GO biological process analysis of potential targets of Erxian decoction in treatment of depression(only top 20 are displayed)

2.5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)分析“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖共由61個(gè)活性成分(其中八個(gè)活性成分名稱較長(zhǎng),用阿拉伯?dāng)?shù)字1～8代替,見Tab 2)，44個(gè)靶點(diǎn)，24條通路共同構(gòu)建，見Fig 3。其中，二仙湯與抑郁癥的共有靶點(diǎn)有12個(gè)。以整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的Degree中位數(shù)的兩倍即8，篩選出重要的節(jié)點(diǎn)。結(jié)果顯示，在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，活性成分類的節(jié)點(diǎn)有四個(gè)具有高Degree值。槲皮素(quercetin，Degree=32)來自仙靈脾和黃柏；木犀草素(luteolin，Degree=22)來自仙靈脾；β-谷甾醇(beta-sitosterol，Degree=9)來自仙茅，巴戟天，當(dāng)歸，黃柏；山奈酚(kaempferol，Degree=11)來自仙靈脾和知母。靶點(diǎn)類的節(jié)點(diǎn)中有15個(gè)具有高Degree值：PTGS2(Degree=56)、ADRB2(Degree=24)、MAPK1(Degree=20)、AKT1(Degree=19)、RKCA(Degree=15)、RELA(Degree=14)、NOS3(Degree=13)、MAPK14(Degree=12)、GSK3B(Degree=11)、MAPK8(Degree=10)、TNF(Degree=10)、JUN(Degree=10)、CASP3(Degree=8)、IL6(Degree=8)、OPRM1(Degree=8)。其中除PRKCA、RELA、CASP3外，其余12個(gè)靶點(diǎn)均是二仙湯與抑郁癥的共有靶點(diǎn)。通路類的節(jié)點(diǎn)中有13條通路具有高Degree值，其中與細(xì)胞凋亡有關(guān)的富集通路為PI3K-Akt signaling pathway(Degree=18)、MAPK signaling pathway(Degree=14)、FoxO signaling pathway(Degree=12)、Ras signaling pathway(Degree=10)、JAK-STAT signaling pathway(Degree=9)；與突觸可塑性相關(guān)的ERBB signaling pathway(Degree=9)；與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的為Neurotrophin signaling pathway(Degree=8)、cAMP signaling pathway(Degree=8)、VEGF signaling pathway(Degree=8)；與免疫相關(guān)的TNF signaling pathway(Degree=17)、Cytokine-cytokine receptor interaction(Degree=10)、Chemokine signaling pathway(Degree=8)。

Tab 2 The “ compound-target-pathway”network replaced long compound names by Arabic numerals

Fig 3 The “ compound-target-pathway”network of Erxian decoction in treatment of depression

2.6 分子對(duì)接結(jié)果結(jié)合自由能是SystemsDock 來評(píng)價(jià)配體與受體的結(jié)合穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)，得出的分值見Tab 3。一般分值大于5.25說明分子與靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性，大于7.0說明分子與靶點(diǎn)的結(jié)合構(gòu)型具有強(qiáng)烈的活性[5]。從分子對(duì)接的結(jié)果看，仙茅、當(dāng)歸、黃柏、知母的共有活性成分豆甾醇(Stigmasterol)，仙茅、巴戟天、當(dāng)歸的共有活性成分β-谷甾醇(beta-sitosterol)與PTGS2的對(duì)接分?jǐn)?shù)較高；二仙湯與抑郁癥的共有靶點(diǎn)中AKT1與對(duì)應(yīng)活性成分Luteolin、MAPK1與對(duì)應(yīng)活性成分Luteolin對(duì)接分?jǐn)?shù)較高，說明預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)與活性成分具有良好的結(jié)合能力，為后續(xù)的網(wǎng)路分析奠定基礎(chǔ)。

Tab 3 Molecular docking with high scores of potential targets and corresponding compounds in Erxian decoction

3 討論

抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，二仙湯是上海中醫(yī)藥大學(xué)張伯訥教授20世紀(jì)50 年代針對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征研制出的方劑，主要用于治療更年期綜合征，也是治療抑郁癥的重要方，方中知母瀉火而滋腎保陰，并以助心火之下降，配合壯陽藥同用對(duì)陰陽俱虛于下，而又有虛火上炎的見有腎精不足和相火旺者，療效顯著，但目前對(duì)二仙湯抗抑郁癥的作用機(jī)制沒有系統(tǒng)研究。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過構(gòu)建二仙湯“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，對(duì)二仙湯抗抑郁的主要活性成分、重要靶點(diǎn)及潛在機(jī)制進(jìn)行了分析。在成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中篩選出4個(gè)二仙湯的重要活性成分，分別為槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。文獻(xiàn)報(bào)道這些活性成分與抑郁癥均有明顯聯(lián)系。其中，quercetin具有抗氧化、抗炎、降低細(xì)胞毒性、增加5-羥色胺水平等發(fā)揮抗抑郁作用[6]；luteolin可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗抑郁作用[7]；kaempferol可抑制神經(jīng)元凋亡并促進(jìn)神經(jīng)再生[8]；抑郁小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間可被β-sitosterol顯著縮短[9]，其機(jī)制可能是增加5-HT和NE在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的含量。這提示，二仙湯可能通過這些活性成分來發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。值得注意的是，quercetin、luteolin、kaempferol均來自二仙湯的君藥仙靈脾，這與中醫(yī)君臣佐使理論不謀而合，突出了君藥的作用。此外，beta-sitosterol來自二仙湯的仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏，quercetin來自二仙湯的仙靈脾、黃柏，kaempferol來二仙湯的自仙靈脾、知母，luteolin來自二仙湯的仙靈脾。這些重要活性成分來源于二仙湯各味中藥，多活性成分共同起效，表明二仙湯具有多中藥、多成分協(xié)同抗抑郁效應(yīng)。

通過分析成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中Degree值篩選出15個(gè)重要的二仙湯成分靶點(diǎn)，其中12個(gè)是二仙湯與抑郁癥的共有靶點(diǎn)，這提示二仙湯可能通過這些共同靶點(diǎn)發(fā)揮直接的抗抑郁效應(yīng)。例如，Degree值大于15的靶點(diǎn)PTGS2、ADRB2、ADRB1與抑郁癥密切相關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PTGS2可降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)來發(fā)揮抗抑郁作用[10]。ADRB2調(diào)節(jié)的差異可能是重度抑郁癥治療起效的基礎(chǔ)[11]。此外，這些靶點(diǎn)均對(duì)應(yīng)了多個(gè)活性成分，如PTGS2來自beta-sitosterol等52個(gè)活性成分，ADRB2來自quercetin等22個(gè)活性成分，這說明二仙湯具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同抗抑郁的效應(yīng)。

在“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中，與抑郁癥相關(guān)的24條通路共篩選出13條富集通路，且這13條通路都包括在細(xì)胞凋亡、神經(jīng)再生，突觸可塑性，免疫炎癥中。

神經(jīng)細(xì)胞受損、凋亡是抑郁癥的一個(gè)重要病理機(jī)制。在細(xì)胞凋亡方面，包括4條富集信號(hào)通路:PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Fox信號(hào)通路。PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化并在細(xì)胞自噬中扮演重要角色[12]，還具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。Akt介導(dǎo)Fox通路參與調(diào)控細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用，發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。還有研究發(fā)現(xiàn)，目前抗抑郁藥的療效與Ras信號(hào)通路有關(guān)[13]。Ras信號(hào)通路下游能激活MAPK等信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，二仙湯抗抑郁癥涉及到的中藥為仙靈脾、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母； 涉及到的活性成分為quercetin、luteolin、kaemferol等共20個(gè)；涉及到的靶點(diǎn)為EGFR、IL-6、PTEN等共28個(gè)參與到這三條通路中。

突觸可塑性是大腦對(duì)應(yīng)激作出的各種適應(yīng)性改變，突觸可塑性異常會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元反應(yīng)適應(yīng)性不良及異常。研究表明，慢性應(yīng)激可降低海馬突觸的可塑性。與突觸可塑性相關(guān)的富集通路是ERBB信號(hào)通路。NRG1-ErbB4信號(hào)通路不僅參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的功能，而且對(duì)突觸可塑性的形成及神經(jīng)遞質(zhì)受體的表達(dá)都具有重要影響[14]。此外，在突觸可塑性中，除了ERBB信號(hào)通路這一條富集通路，還包含了5-HT、DA突觸及LTD、LTP等與抑郁癥密切相關(guān)的經(jīng)典通路。長(zhǎng)時(shí)程抑制(LTD)和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和是突觸可塑性的兩種主要表現(xiàn)形式，5-HT和DA在LTD與LTD中具有關(guān)鍵作用。從我們的研究成果來看，二仙湯抗抑郁癥涉及到的中藥為仙靈脾、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母； 涉及到的活性成分為luteolin、quercetin、kaempferol等共12個(gè)；涉及到的靶點(diǎn)為PRKCA、AKT1、EGFR等共9個(gè)參與到這條通路中。

神經(jīng)發(fā)生障礙是抑郁癥產(chǎn)生的關(guān)鍵病理機(jī)制。研究證實(shí)，神經(jīng)發(fā)生減少的動(dòng)物模型表現(xiàn)出類抑郁樣行為。在神經(jīng)發(fā)生方面，有3種富集途徑:cAMP信號(hào)途徑、VEGF信號(hào)途徑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)途徑。抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與cAMP途徑密切相關(guān)。研究表明，抗抑郁藥物不僅可以上調(diào)受體細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，還可以增加海馬細(xì)胞內(nèi)蛋白kinaseA (PKA)和CREB mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)CREB蛋白與cAMP反應(yīng)元件(cAMP response element, CRE)的結(jié)合。抑郁癥動(dòng)物模型已經(jīng)證明，BDNF表達(dá)水平降低和海馬神經(jīng)發(fā)生的減少與抑郁樣行為同時(shí)發(fā)生，而海馬神經(jīng)元損傷的修復(fù)與BDNF及相關(guān)其相關(guān)傳導(dǎo)通路如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通路密切相關(guān)[15]。另外，有研究表明BDNF可能是通過調(diào)節(jié)與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的因子如VEGF和糖皮質(zhì)激素等間接性影響神經(jīng)發(fā)生。從我們的研究結(jié)果來看，二仙湯抗抑郁癥涉及到的中藥為仙靈脾、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母； 涉及到的活性成分luteolin、quercetin、kaempferol等共58個(gè)；涉及到的靶點(diǎn)為AKT1、MAPK1、MAPK14等共16個(gè)參與到這3條通路中。

免疫炎癥反應(yīng)是抑郁癥的重要發(fā)病機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者存在廣泛的免疫異常。在免疫炎癥方面，包含三條富集通路：趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路。調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答生物活性的主要信號(hào)分子是細(xì)胞因子，文獻(xiàn)報(bào)道抑郁患者血清中IL-1、IL-6、TNF-α等促炎因子的水平明顯升高，抗抑郁治療后，促炎因子恢復(fù)到正常水平[16]。趨化因子信號(hào)通路可作用于免疫炎癥[17]，阻斷單個(gè)趨化因子往往就能明顯地抑制炎癥反應(yīng)。TNF信號(hào)通路與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥密切相關(guān)。從我們的研究結(jié)果來看，二仙湯抗抑郁癥涉及到的中藥為仙靈脾、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母； 涉及到的活性成分為luteolin、quercetin、kaempferol等共53個(gè)；涉及到的靶點(diǎn)為ICAM1、IL-6、TNF等共24個(gè)參與到這3條通路中。

以上分析表明，二仙湯具有多通路協(xié)同抗抑郁效應(yīng)。比如，PI3K/Akt信號(hào)通路、Fox信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路可協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在這些途徑中存在著許多共同靶點(diǎn)，能夠進(jìn)行信號(hào)通路對(duì)話。如AKT1，抗抑郁藥物既能磷酸化AKT1，通過PI3K/Akt的下游調(diào)控靶點(diǎn)mTOR及Fox來發(fā)揮改善細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)PI3K-Akt通過調(diào)控下游mTOR又還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性的調(diào)節(jié)，調(diào)控突觸蛋白的合成的作用。

綜上所述，二仙湯抗抑郁的活性成分包括槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇，山奈酚等；涉及的靶點(diǎn)包括PTGS2、ADRB2、MAPK1、AKT1、RKCA、RELA、NOS3、MAPK14、GSK3B、MAPK8、TNF、JUN、CASP3、IL-6、OPRM等；可通過PI3K-Akt信號(hào)通路等改善細(xì)胞凋亡、ERBB信號(hào)通路等調(diào)節(jié)突觸可塑性、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路等促進(jìn)神經(jīng)再生、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)發(fā)揮協(xié)同抗抑郁效應(yīng)，體現(xiàn)了中藥復(fù)方二仙湯治療抑郁癥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。本研究的不足之處在于，對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果只采用了分子對(duì)接進(jìn)行驗(yàn)證。雖然分子對(duì)接可行性很強(qiáng)，已經(jīng)逐漸深入到中藥研究的各個(gè)方面，但計(jì)算機(jī)結(jié)果不能取代實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，最終還是需要生物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。