骨肽原液促UMR106細胞增殖法的建立及驗證

吳彥霖，張 媛，楊澤岸，胡文言，高 華

(1.中國食品藥品檢定研究院化學(xué)藥品檢定所藥理室, 北京 102629; 2.中國生化制藥工業(yè)協(xié)會，北京 100068)

骨肽是從新鮮或冷凍的豬、鹿或胎牛骨提取，加工制成的具有活性的多組分生化藥[1-2]，骨肽類藥物主要成分含有骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)等多種多肽類骨代謝活性因子，以及多種骨修復(fù)所需的無機元素、氨基酸及微量元素等[3]。骨肽類藥物臨床上主要用于骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增生、骨折及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病治療，具有刺激成骨細胞增殖，促進新骨形成，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[4-5]。骨肽原液是骨肽類藥物的原料，具有組分復(fù)雜，活性成分不明確的特點，現(xiàn)行的骨肽類藥物質(zhì)量標準收載于國家標準地升部十六冊，采用理化方法進行質(zhì)量控制，不能有效反映其多組分、多靶點的臨床療效[6]，因此建立關(guān)聯(lián)臨床功效的生物活性測定方法作為其質(zhì)量控制的方法更為合理。

大鼠骨肉瘤細胞UMR106在形態(tài)和性質(zhì)上保留有成骨細胞的特征，在研究中被用來代替成骨細胞，是一種國際公認的成骨樣細胞，也是研究骨代謝調(diào)控較好的模式細胞[7-9]。建立骨肽原液生物活性測定方法-大鼠骨肉瘤UMR106細胞增殖實驗，確定骨肽原液的限值，依據(jù)正交實驗確定方法的影響因素，并參照2015年版《中國藥典》9101 藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則和9105中藥生物活性測定指導(dǎo)原則進行方法學(xué)驗證[10]。

基于上述目的，建立骨肽原液生物活性測定方法研究包括：1)建立UMR106細胞增殖實驗方法；2)正交試驗優(yōu)化實驗條件，確定實驗方案；3)對建立的骨肽原液促UMR106細胞增殖實驗進行方法學(xué)驗證；4)對13個廠家共39批次的骨肽原液進行實驗，依據(jù)實驗結(jié)果制定相應(yīng)的限值和判斷標準。

1 材料與方法

1.1 細胞株大鼠骨肉瘤細胞株UMR106，購于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞中心。

1.2 儀器CKX 41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；1389 A2生物安全柜(美國Thermo Fisher公司)；3141 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；6R離心機(美國Beckman Coulter公司)：Z2細胞計數(shù)儀(美國Beckman Coulter公司)；SYNERGY HT酶標儀(美國Biotek公司)。

1.3 試劑及樣品胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、含谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基(Glutamine+, Glu+)、不含谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基(Glutamine-, Glu-)、胰酶均購自Gibco公司，批號分別為1989478、2044404、1998036、2053591；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)購自Hyclone公司，批號AD20616267；CCK-8購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司，批號NN707。 骨肽原液生產(chǎn)廠家及批號見Tab 1。

Tab 1 Manufacturer and batch number of bone peptide

1.4 溶液配制生長培養(yǎng)基：用DMEM高糖培養(yǎng)基(Glu+)配制含10%FBS的溶液；工作培養(yǎng)基：用DMEM高糖培養(yǎng)基(Glu-)分別配制含1%、5%、10%的FBS溶液，上述溶液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

骨肽的樣品稀釋液：用工作培養(yǎng)基配將骨肽原液稀釋為0.06、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 g·L-1的溶液，臨用現(xiàn)配。

1.5 細胞傳代取對數(shù)生長期UMR106細胞融合度達到90%進行傳代，吸棄瓶中培養(yǎng)基，取10 mL PBS清洗1遍，加2 mL 0.25% Trypsin置CO2培養(yǎng)箱中消化30 s，加10 mL生長培養(yǎng)基終止消化，吹落培養(yǎng)瓶上貼壁細胞，將細胞懸液移至15 mL離心管中，充分混勻，1 000 r·min-1離心5 min，離心后盡量除去上清液，加入1 mL生長培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻細胞沉淀。將細胞懸液按1 ∶5比例接種至T75培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.6 骨肽原液致UMR106細胞增殖方法建立將2.2消化后的細胞用PBS洗2次，每次1 000 r·min-1離心5 min，用工作培養(yǎng)基稀釋細胞至所需濃度，每孔100 μL接種于96孔細胞培養(yǎng)板。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。棄去孔內(nèi)完全培養(yǎng)基，每孔加入骨肽的樣品稀釋液，設(shè)不加細胞的孔為完全空白組，陰性對照組(等量PBS代替藥物體積)。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后使用CCK-8法進行測定細胞增殖率，實驗操作參照試劑盒說明書。

細胞增殖率/% =(供試品組A值-完全空白組A值)/(陰性對照組A值-完全空白組A值)×100%

1.6.1線性范圍和最低檢測限 取2.3細胞，調(diào)整細胞密度為2 000 個/孔，用1% FBS工作培養(yǎng)基將廠家B(batch No. 1)和C(batch No. 1)骨肽原液配制為2.1的濃度，每孔分別加入對應(yīng)的組別藥物100 μL，作用48 h、72 h后計算細胞增殖率[7-9]，以細胞增殖率評價骨肽原液促UMR106細胞增殖活性，確定最低檢測限。

1.6.2正交實驗確定影響因素 選用廠家B(batch No. 1)的骨肽原液樣品進行正交實驗，正交設(shè)計方案：采用L9 (33)正交表，以3因素3水平正交實驗為考察條件進行實驗，具體見Tab 2和Tab 3。響應(yīng)值為細胞增殖百分率。 正交實驗設(shè)計表如下表所示。

Tab 2 Factors and levels of orthogonal experiment

Tab 3 Arrangement of orthogonal experiment

1.7 方法學(xué)驗證[10]

1.7.1重復(fù)性 參考2.3.2正交實驗結(jié)果，選用廠家B(batch No. 1)的骨肽原液樣品進行重復(fù)性檢驗，按實驗方案：樣品濃度為1.0 g·L-1，培養(yǎng)基血清含量為2.5% FBS，鋪板細胞數(shù)量為5 000 個/孔。進行3次獨立試驗，統(tǒng)計結(jié)果并進行評價。

1.7.2中間精密度 選用廠家B(bath No. 1)的骨肽原液樣品進行中間精密度檢驗，3名實驗人員按實驗方案：骨肽原液樣品濃度為1.0 g·L-1，培養(yǎng)基血清含量為2.5% FBS，鋪板細胞數(shù)量為5 000 個/孔。分別進行獨立試驗，統(tǒng)計結(jié)果并進行評價。

1.7.3耐用性 選用廠家B(bath No. 1)的骨肽原液樣品進行中間精密度耐用性檢驗，分別考察實驗中一些測定條件的微小變化，包括：不同細胞鋪板密度：4 500、5 000、5 500 個/孔；96孔細胞培養(yǎng)板上藥物作用于不同位置；藥物作用時間：68、72、76 h。測定結(jié)果不受影響，以確保方法的可靠性。

1.8 限值及判斷標準的制定取2.3細胞，將13個生產(chǎn)廠家共39批骨肽原液，每孔加入100 μL含1.0 g·L-1骨肽的樣品稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后測定細胞增殖率。以樣品合格率>60%作為界限，制定骨肽原液的判斷標準。

2 結(jié)果

2.1 建立骨肽原液致UMR106細胞增殖方法

2.1.1線性及最低檢測限 骨肽原液藥物濃度在0.06～2.0 g·L-1范圍內(nèi)對UMR106細胞的影響見Fig 1。廠家B(batch No. 1)和C(batch No. 1)的骨肽原液對UMR106細胞有促進增殖作用，在48～72 h、0.06～1.0 g·L-1范圍內(nèi)對UMR106細胞增殖作用呈時間-劑量依賴性，但廠家C的骨肽原液在48 h的2.0 g·L-1濃度劑量增殖呈下降趨勢，骨肽原液對UMR106細胞增殖的最低檢測限為0.06 g·L-1。

Fig 1 UMR106 cell proliferation of bone peptide solution, manufacturers B and C n=2)

2.1.2正交實驗結(jié)果 根據(jù)2.3.2計算正交試驗結(jié)果，在促UMR106細胞增殖實驗的3個因素影響程度是：骨肽原液濃度>培養(yǎng)基血清含量>細胞數(shù)量。結(jié)合顯微鏡下細胞形態(tài)的分析結(jié)果，確定骨肽生物活性測定方法-UMR106細胞增殖實驗方案為：骨肽原液濃度為1.0 g·L-1，工作培養(yǎng)基血清含量為2.5% FBS，鋪板細胞數(shù)量為5 000 個/孔。

2.2 方法驗證結(jié)果

2.2.1重復(fù)性結(jié)果 1名檢驗人員獨立對廠家B(bath No. 1)的骨肽原液樣品進行3次實驗，UMR106細胞增殖率均值為247%，RSD=13%，表明此方法的重復(fù)性良好，結(jié)果見Tab 4。

Tab 4 Repeatability for UMR106 cell proliferation experiment (n=4,%)

2.2.2中間精密度結(jié)果 3名實驗人員對廠家B(batch No. 1)的骨肽原液樣品進行1次實驗，按確定方案測定UMR106細胞增殖率，增殖率均值為261%，RSD=16%，表明此方法的中間精密度良好，見Tab 5。

Tab 5 Intermediate precision for UMR106 cell proliferation experiment (n=3,%)

2.2.3耐用性結(jié)果 對廠家B(batch No. 1)的骨肽原液樣品，按確定方案測定UMR106細胞增殖率，結(jié)果表明：1)不同細胞鋪板密度條件下，增殖率均值為224%，RSD=2%；2)96孔細胞培養(yǎng)板上藥物作用于不同位置條件下，增殖率均值為214%，RSD=5%；3)藥物作用不同時間條件下，增殖率均值為208%，RSD=8%(Tab 6～8)。

Tab 6 Durability for UMR106 cell proliferation experiment (different cell density) (%)

Tab 7 Durability for UMR106 cell proliferation experiment (cell plates in different positions of 96 well) (%)

Tab 8 Durability for UMR106 cell proliferation experiment (drug treated time)

2.3 限值及判定標準的確定13個生產(chǎn)廠家39批骨肽原液中，有8個廠家的骨肽原液促UMR106細胞增殖率≥150%，5個廠家的骨肽原液促UMR106細胞增殖率<150%(Tab 9)。

Tab 9 Proliferation of UMR106 cells by 13 manufacturers (n=6)

3 討論

3.1 質(zhì)量標準和限值建立骨肽原液致UMR106細胞增殖實驗方法，并參照2015年版《中國藥典》9101 藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則和9105中藥生物活性測定指導(dǎo)原則，進行重復(fù)性、中間精密度、耐用性等方法學(xué)驗證[10]，結(jié)果表明，骨肽原液促UMR106細胞增殖法重復(fù)性、中間精密度和耐用性良好，實驗中一些測定條件的微小變化不會影響細胞增殖率，此方法可靠。且該方法操作簡單，實驗測定結(jié)果穩(wěn)定，測定指標與骨肽類制劑藥物的治療作用密切相關(guān)，可作為骨肽原液的質(zhì)量評價方法。

結(jié)合3.3實驗結(jié)果得出骨肽原液致UMR106細胞增殖實驗的結(jié)論，以1.0 g·L-1骨肽原液藥物濃度作為限值劑量，增殖率≥150%作為符合規(guī)定的判定標準，樣品合格率>60%，限值劑量及判斷標準制定較合理，其中E、F兩個廠家促UMR106細胞增殖率接近150%，屬于邊緣產(chǎn)品。13個生產(chǎn)廠家骨肽原液不同批次間實驗結(jié)果一致，表明實驗方法適用性較好，故可作為骨肽原液生物活性測定方法，以更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量。

3.2 骨形成的階段骨形成的過程主要涉及四個階段：骨形成初期成骨細胞數(shù)量明顯增加，而后進入成骨細胞分化階段，細胞外基質(zhì)成熟，骨特征性蛋白表達，促進并參與基質(zhì)礦化，最終完成骨形成。 成骨細胞的數(shù)量決定骨形成的最初速度，大鼠骨肉瘤細胞UMR106在形態(tài)和性質(zhì)上保留有成骨細胞的特征，在骨肽類制劑成骨研究中具有代表性[7-9]。骨肽類制劑的臨床藥理作用有刺激成骨細胞增殖，促進新骨形成，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，增加骨鈣沉淀及抗炎、鎮(zhèn)痛等。臨床上主要用于骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)增生性疾病、骨折及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等治療。成分復(fù)雜、活性成分不明確的骨肽類制劑生物活性評價方法的建立應(yīng)以其最主要的臨床治療功效作為靶點，進行方法學(xué)研究，因此筆者選擇骨形成中成骨作用進行了上述研究。

Glu是細胞培養(yǎng)基中常用的添加物，但在UMR106 細胞增殖實驗中，Glu的存在對結(jié)果存在影響。因此在使用該法對同類多組分藥物進行生物活性評價研究時，筆者建議應(yīng)考慮樣品中的Glu含量對實驗的干擾作用。