奧曲肽治療TNBS致大鼠潰瘍性結(jié)腸炎及其機制研究

朱 銳，何 靈，唐 瑤，白 杰

(新疆醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種常見的腸道性疾病，在臨床上主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉以及粘液膿血便等。此病的發(fā)病機制尚不明確，目前已知主要受遺傳基因的易感性、免疫受損和環(huán)境因素等聯(lián)合導致的腸道粘膜炎癥反應有關。臨床上治療UC的常見藥物為水楊酸、糖皮質(zhì)激素類，這類藥物缺乏特效性，毒副作用較大，因此無法長期使用[1]。越來越多的研究表明，細胞因子在發(fā)病機制中起著關鍵作用，其中促炎性細胞因子和抑炎性細胞因子之間的平衡失調(diào)被認為是UC的重要發(fā)病機制之一。2，4，6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonicacid，TNBS)是一種有機酸半抗原物質(zhì)。可進入腸道，其結(jié)構中的三硝基苯基殘基能與腸組織高分子組織蛋白以共價形式結(jié)合，改變表面蛋白質(zhì)，從而形成自身抗原，使腸道內(nèi)激活針對自身抗原的遲發(fā)性超敏反應，進而誘發(fā)結(jié)腸炎的發(fā)生[2]。奧曲肽(Octreotide)是一種人工合成的化合物，能有效的緩解水電解質(zhì)失衡癥狀，抑制胃液，腸液等消化液分泌, 奧曲肽還具有與生長抑素相似的作用，可以抑制消化液分泌、腸胃蠕動，緩解結(jié)腸炎患者腹痛、腹瀉、嘔吐的癥狀[3]。因其較天然生長抑素具有半衰期長，使用方便，價格便宜等優(yōu)點，常用于輔助治療潰瘍性結(jié)腸炎。本課題組前期研究表明[4]，隱孢子蟲感染建立的腸易激綜合征小鼠模型經(jīng)腹腔注射奧曲肽(50 μg·kg-1·d-1)后，可通過降低生長抑素受體4(somatostatin receptor 4，SSTR4)和SSTR5的表達，改善腸易激綜合征。因此，本實驗擬以TNBS誘導SD大鼠建立UC模型后，研究奧曲肽對UC的治療作用及作用機制，為奧曲肽用于UC臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠♀♂各半、體質(zhì)量(180～220) g,由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，使用許可編號：SYXK(新)2018-0003，SPF級環(huán)境下適應性喂養(yǎng)7 d。

1.2 實驗試劑醋酸奧曲肽注射液，諾華制藥，批號：S0512；柳氮磺胺吡啶(SASP)腸溶片，上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號：09170629； ELISA試劑盒,上海鈺博公司；PI3K、AKT1、p-AKT1抗體，免疫組化試劑盒，均購自Elascience公司；3%過氧化氫、PBS緩沖液粉末、檸檬酸鈉粉末、DAB染色液、蘇木素染液、中性樹膠，均購自中杉金橋；無水乙醇，富宇試劑；生理鹽水，四川科倫藥業(yè)有限公司；戊巴比妥鈉粉劑，金鑫天佑公司；TNBS，Sigma公司，批號：P2297；4%多聚甲醛，索萊寶公司。

1.3 實驗儀器全自動酶標儀，Multikan GO,Thermo公司；Nano Drop核酸定量儀，Thermo公司；高速低溫離心機，MULTIFUEGX-3R, Thermo公司；37 ℃水浴鍋，常溫切片機醫(yī)用微波爐，顯微鏡，染色缸，蓋玻片。

1.4 主要溶液的配置

1.4.1TNBS灌腸溶液 將無水乙醇用蒸餾水稀釋成濃度為50%的溶液，再用5% TNBS與50%乙醇等體積混勻，存入4 ℃冰箱避光保存。

1.4.2陽性藥灌胃液 柳氮磺胺吡啶腸溶片給藥量為0.4 g·kg-1，研細后溶于3 mL 0.9%生理鹽水中,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 動物分組以及模型的制備70只SD大鼠，采用完全隨機分組法，將大鼠分為4組：正常對照組16只、模型(TNBS)組22只、奧曲肽給藥組16只、陽性給藥組16只。70只SD大鼠造模前禁食不禁飲24 h，操作前，先將大鼠刺激排便并記錄體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量注射戊巴比妥鈉，待其麻醉后，用涂抹液體石蠟的醫(yī)用聚乙烯管緩慢插入大鼠肛門，深度9～10 cm，正常對照組等體積0.9%生理鹽水灌腸，其余3組均給予TNBS/乙醇灌腸液灌腸，灌腸后捏緊肛門保持倒懸體位30 s，之后保持肛門高位5 min防止藥物流出，放置在籠中，自由進食、水。

1.6 致病性的確定在TNBS誘導24 h以后，隨機處死模型組6只大鼠，3%戊巴比妥鈉麻醉后取結(jié)腸病變部位，用4%多聚甲醛溶液固定，常溫放置48 h后取2 cm左右用于石蠟包埋，HE染色。觀察誘導部位及嚴重程度，確定UC大鼠模型是否建立成功。

1.7 癥狀、體征觀察及評分每日觀察大鼠進食、飲水、皮毛以及活動狀態(tài)的變化，稱量體質(zhì)量，觀察糞便性狀，有無便血。進行疾病活動指數(shù)(DAI)評分。根據(jù)肉眼觀察結(jié)腸外觀形態(tài)，是否存在腸粘連，進行結(jié)腸粘膜大體病變(CMDI)評分。在顯微鏡下隨機觀察HE染色切片5個不同的視野，進行結(jié)腸組織病理(TDI)評分。

1.8 HE染色及組織病理學觀察分離結(jié)腸，采集標本，取病變明顯處約2 cm的結(jié)腸組織，4%多聚甲醛固定、常規(guī)脫水，包埋切片后，進行HE染色，在顯微鏡下觀察腸粘膜損傷情況。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α及PLA2按照ELISA試劑盒說明書檢測組織勻漿中的IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α及PLA2含量水平。

1.10 免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)按照試劑盒操作進行免疫組化染色。在光鏡下每個切片至少采集5個不同的視野圖像，使用Image Pro Plus軟件根據(jù)IOD值，比較AKT1、p-AKT1、PI3K蛋白的表達水平。

1.11 Real time-PCR檢測結(jié)腸PI3K、AKT mRNA水平稱取100 mg大鼠結(jié)腸組織提取RNA，測定總RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后于-20 ℃保存。根據(jù)NCBI Geenbank查找基因序列，使用NCBI Primer BLAST功能對產(chǎn)物進行驗證，合格基因序列由生工生物工程股份有限公司合成。引物序列見Table 1。依據(jù)2-ΔΔCT法計算mRNA的表達。每個樣本均為2復孔，總反應體系為20 μL，反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，57 ℃ 34 s。根據(jù)樣本CT值進行相關計算，根據(jù)熔解曲線判斷PCR產(chǎn)物是否具有特異性。

Tab 1 Primer sequences used for PI3K and AKT1 detection with real time-PCR

2 結(jié)果

2.1 奧曲肽對UC大鼠DAI評分的影響實驗期間，正常組大鼠飲食正常，毛發(fā)有光澤，活躍度較高，無腹瀉、便血現(xiàn)象。其余3組在TNBS誘導24 h后均出現(xiàn)不同程度飲食量下降，稀便、肉眼可見血便，活躍度降低等。如Tab 2所示，與正常對照組比較，模型組評分升高，差異具有顯著性(P<0.01)。奧曲肽給藥組于給藥d 2后稀便、軟便漸停，飲食、活動均有所增加，與模型組比較，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。d 3奧曲肽給藥組明顯好轉(zhuǎn)，與模型組比較，差異具有顯著性(P<0.01)與陽性藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明奧曲肽與陽性藥相比，能在早期對UC起到治療作用。

2.2 奧曲肽對UC大鼠結(jié)腸粘膜以及CMDI評分的影響末次給藥后次日，正常組大鼠結(jié)腸粘膜光滑潤澤，腸壁紋理清晰，不增厚，腸道無粘連，未見充血、水腫、糜爛及潰瘍。模型組SD大鼠結(jié)腸可見大面積潰瘍形成，潰瘍周圍水腫、充血，腸腔擴張增粗，腸壁增厚，部分大鼠出現(xiàn)腸道之間或結(jié)腸與周圍組織如腹膜等嚴重粘連，病變處發(fā)生增生，病變部位內(nèi)殘留大量糞便，糞便不能通過，沿腸系膜縱剖結(jié)腸，生理鹽水沖洗干凈后可見明顯黑色結(jié)痂。模型組CMDI評分，與正常對照組比較，差異有顯著性(P<0.01)。奧曲肽給藥組結(jié)腸潰瘍面積明顯縮小，充血、水腫消失，腸腔未見粘連，無梗阻發(fā)生，沿腸系膜縱剖結(jié)腸后未見明顯黑色結(jié)痂。奧曲肽給藥組CMDI評分模型組比較、差異有顯著性(P<0.01)。SASP組病變程度有所改善，結(jié)腸潰瘍面積減少，少數(shù)大鼠腸壁可見變厚，腸腔有一處變大或狹窄，與周圍組織有輕度粘連。見Tab 3。

Tab 2 Effect of Octreotide on DAI score of UC

Tab 3 Effect of Octreotide on CMDI score of UC

2.3 奧曲肽對結(jié)腸病理組織損傷評分(TDI)的影響如Fig 1所示，正常組大鼠粘膜上皮細胞排列整齊緊密，杯狀細胞較多，腺體性狀未見異常，偶見少量炎癥細胞浸潤，無充血、潰瘍及水腫。模型組鏡下明顯可見粘模層大量中性粒以及數(shù)量不等的嗜酸性粒細胞浸潤，可見多處糜爛、潰瘍形成，粘膜層缺失，杯狀細胞輕度減少，腺體消失，腸道組織結(jié)構紊亂，結(jié)腸粘膜固有肌層出現(xiàn)增厚現(xiàn)象。模型組TDI評分明顯升高，與正常組比較，差異有顯著性(P<0.01)。奧曲肽組病變程度明顯減輕，主要表現(xiàn)為炎癥浸潤大量減少，并且炎癥浸潤僅局限于粘模層，潰瘍面積顯著減少，腺體修復，腸粘膜組織結(jié)構未見明顯異常。奧曲肽組TDI評分與模型組相比，差異有顯著性(P<0.01)。SASP組鏡下可見結(jié)腸粘膜固有肌層出現(xiàn)增厚現(xiàn)象，大量中性粒細胞及數(shù)量不等的嗜酸性粒細胞浸潤，有明顯潰瘍、糜爛，腸道組織結(jié)構紊亂，腺體破壞甚至消失。見Tab 4。

Fig 1 HE-stained colon sections(×100)A：Normal；B：Model；C：Octreotide；D：SASP

Tab 4 Effect of Octreotide on TDI score of UC

2.4 奧曲肽對UC大鼠組織勻漿IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PLA2含量的影響如Fig 2所示，給藥7 d后，模型組與正常組相比，組織勻漿中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PLA2的表達均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比較，奧曲肽組大鼠結(jié)腸組織勻漿中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PLA2的表達均明顯降低(P<0.01)。

Fig 2 Change of tissue homogenate levels of IL-1β, IL-6, IL-8, PLA2, TNF-α in **P<0.01 vs normal;#P<0.05,##P<0.01 vs model

2.5 AKT1、p-AKT1、PI3K在大鼠結(jié)腸粘膜原位蛋白的表達如Fig 3、4、5所示, 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn) PI3K、AKT1、p-AKT1蛋白表達在粘膜下層和腸絨毛部位，且均在細胞質(zhì)表達。與正常組相比，模型組結(jié)腸中AKT1、p-AKT1、PI3K蛋白的表達明顯升高(P<0.01)；給藥后，與模型組比較，奧曲肽組結(jié)腸AKT1、p-AKT1、PI3K蛋白的表達明顯降低(P<0.01)；見Tab 5。

Tab 5 Impact of Octreotide on protein expression of AKT1, p-AKT1, PI3K in colonic mucous of UC n=8)

Fig 3 Impact of Octreotide on protein expression of AKT1 in colon of UC ratsA：Normal(×200)；B：Model(×100)；C：Octreotide(×200)；D：SASP(×100).

Fig 4 Impact of Octreotide on protein expression of p-AKT1 in colon of UC rats(×200)A：Normal；B：Model；C：Octreotide；D：SASP.

Fig 5 Impact of Octreotide on protein expression of PI3K in colon of UC rats(×200)A：Normal；B：Model；C：Octreotide；D：SASP.

2.6 PI3K、AKT1在大鼠結(jié)腸mRNA的表達水平如Fig 6所示，與正常組相比，模型組結(jié)腸中PI3K、AKT1mRNA的表達水平升高(P<0.01)；給藥后，與模型組比較，奧曲肽組結(jié)腸PI3K、AKT1mRNA的表達降低(P<0.01)。

Fig 6 Expression levels of PI3K and AKT1 mRNA in **P<0.01 vs normal;##P<0.01 vs model

3 討論

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)以往在歐美多發(fā)，但是近幾年來，亞洲發(fā)病率呈上升趨勢，流行病調(diào)查資料顯示，中國近20年IBD病例數(shù)也在迅速增加[5]，且多見于青壯年，因此日益受到重視。現(xiàn)階段對其病因和發(fā)病機制仍不十分清楚，除了與遺傳因素、免疫反應異常外，國內(nèi)外大多數(shù)學者研究其具有遺傳易感性的人群，發(fā)現(xiàn)它與大量腸道細菌有關，并認為是由于腸道細菌的改變導致腸粘膜損傷[6]。不管是腸道的原發(fā)性病變還是繼發(fā)性損害，它們共同表現(xiàn)都包括腸粘膜屏障結(jié)構和功能的缺損。而腸粘膜損傷亦是導致IBD發(fā)生的主要原因之一，研究發(fā)現(xiàn)引起腸粘膜損傷的原因包括炎癥因子、免疫異常、腸道菌群失調(diào)等因素[7]。其中炎癥因子包括腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)、血小板活化因子等[8]。IL-1β、IL-6、IL-8等促炎因子是公認為介導UC形成的重要細胞因子[9]。在IBD的病理生理中，磷脂酶A2作為一種關鍵酶，介導很多脂質(zhì)介質(zhì)的產(chǎn)生，例如類花生酸、溶血磷脂和血小板活化因子[10]。通過本實驗研究，我們發(fā)現(xiàn)模型組與對照組相比，組織勻漿中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PLA2的水平均顯著增多，而奧曲肽組能夠明顯降低IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α及PLA2的水平。結(jié)果提示奧曲肽通過抑制促炎因子以及PLA2、TNF-α的產(chǎn)生從而實現(xiàn)了對UC大鼠的腸粘膜保護作用。此結(jié)果與其他既往研究中藥物對于UC的治療和有關炎癥因子的影響相一致。

核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)作為一種調(diào)節(jié)各種細胞因子之間的轉(zhuǎn)錄因子，在復雜的細胞因子網(wǎng)絡失調(diào)中，NF-κB的活化是一個關鍵環(huán)節(jié)。IBD中NF-κB活性增高的同時伴有IL-1、IL-6、TNF-α等升高，IL-1和TNF-α可促進NF-κB進一步活化，后者通過正反饋使IL-l和TNF-α分泌進一步增加，同時使其他細胞因子IL-6、IL-8等表達增加，產(chǎn)生級聯(lián)反應，使炎癥過程得以持續(xù)和放大[11]。

異常信號通路在炎癥過程中可導致炎癥反應的失調(diào)，在IBD中，信號通路與炎癥有關的發(fā)病機制息息相關[12]。PI3K是生長因子超家族信號傳導過程中的重要分子，能夠調(diào)節(jié)多種細胞功能，例如凋亡、增殖、代謝等, 并在炎癥和心血管疾病的發(fā)病機制中起重要作用[13]。研究表明， PI3K/AKT信號傳導通路也與細胞因子的調(diào)控和釋放密切相關，如IL-6、IL-8等。此通路被激活后，活化的AKT可以增加NF-κB的磷酸化，減少IκB蛋白合成而激活NF-κB，進而增強細胞促炎因子TNF-α、IL-1β等基因的轉(zhuǎn)錄，導致細胞因子IL-6、IL-8等的失衡，進而引起一系列炎性反應和粘膜損傷[14]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組AKT1、p-AKT1、PI3K蛋白的表達量高于正常組，奧曲肽組較模型組明顯降低，顯示奧曲肽能夠阻斷PI3K/AKT這一信號通路。國內(nèi)外多項研究已經(jīng)證實了PI3K 的活化和PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導通路參與了小鼠結(jié)腸炎和人潰瘍性結(jié)腸炎疾病的發(fā)生發(fā)展，而利用 PI3K 抑制劑 wort-mannin 阻斷該信號轉(zhuǎn)導通路可以明顯減少 NF-κB、TNF-α等細胞因子的產(chǎn)生從而達到抗炎效果[15]。

綜上所述，奧曲肽對SD大鼠UC炎癥有治療作用，通過阻斷PI3K/AKT信號通路，進而降低促炎因子與PLA2、TNF-α的表達水平，緩解炎癥的發(fā)生，阻止結(jié)腸病理惡化，促進腸粘膜修復。

(致謝：衷心感謝新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床研究院的劉輝老師和新疆醫(yī)科大學協(xié)同創(chuàng)新實驗中心的馬文靜老師對實驗提供的幫助和技術支持。)