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    5-Aza-CdR促進小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞HT22自噬增加通過啟動TSC1/mTOR通路

    2020-10-19 01:32:08齊瑞芳包素雅
    中國藥理學(xué)通報 2020年9期
    關(guān)鍵詞:誘導(dǎo)劑神經(jīng)細(xì)胞孵育

    齊瑞芳,包素雅,邵 國

    (1. 包頭醫(yī)學(xué)院低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院,包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所,內(nèi)蒙古 包頭 014060;2. 四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610041)

    自噬是一個進化上保守的細(xì)胞過程,它可以通過溶酶體的降解來回收細(xì)胞成分[1-2]。它是維持應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞存活所必需的新陳代謝的必要過程,包括饑餓、低氧等[3]。自噬的激活與否與腫瘤、神經(jīng)退行性病變、心血管疾病、代謝性疾病、衰老、發(fā)育等息息相關(guān),適度的自噬被認(rèn)為是有益的。據(jù)報道自噬對大鼠大腦的各種損傷起保護作用[4]。 研究報道顯示,自噬的上調(diào)可以保護神經(jīng)元免受缺血性損傷[5]。自噬誘導(dǎo)劑可在鼠模型中保護神經(jīng)元免受應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[6]。甲基化抑制劑5-雜氮脫氧胞嘧啶核苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-CdR)可以誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞K-562 和MEG-01細(xì)胞自噬[7-8]。5-Aza-CdR能否在神經(jīng)細(xì)胞中通過誘導(dǎo)自噬作用進行治療與其相關(guān)的疾病的還需要進一步驗證。

    哺乳動物雷帕雷素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路在自噬的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物(tuberous sclerosis complex,TSC)是由TSC1(又稱為hamartin)和TCS2(又稱tuberin)形成異二聚體,其可以通過TSC2的小GTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein,GAP)結(jié)構(gòu)域而負(fù)調(diào)控mTOR信號傳導(dǎo)[9]。本研究中,通過確定5-Aza-CdR能否對小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞HT22細(xì)胞產(chǎn)生自噬,可否通過TSC1/mTOR通路進行研究,從而為5-Aza-CdR能否作為自噬誘導(dǎo)劑提供更充足的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株HT22細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞庫。

    1.2 試劑DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;胰蛋白酶、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、抗生素(青霉素、鏈霉素等)購自美國Sigma公司;兔抗TSC1多克隆抗體(#4906)、mTOR(#2983),p-mTOR(Ser2448)(#5536),LC3A/B(#4108)購自美國CST公司,5-Aza-CdR(HL-151026)購自西安匯林生物科技有限公司,RIPA裂解液(P0013K)購自杭州碧云天生物技術(shù)公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(ZB2305),Alexa FluorTM594山羊抗兔IgG(A32740)和DAPI(S36939)購自美國Invitrogen公司,ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自北京普利來基因技術(shù)有限公司。

    1.3 儀器NanoDrop 2000紫外分光光度計、Multiskan FC型全自動酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司,熒光定量PCR儀7900HT購自美國ABI公司,垂直電泳槽、蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司,化學(xué)發(fā)光儀天能5800購自上海天能科技有限公司,Nikon A1實時全光譜激光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon公司。

    1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和分組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞HT22培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,37 ℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2條件下培養(yǎng),將細(xì)胞分為對照組和5-Aza-CdR組。

    1.5 5-Aza-CdR處理細(xì)胞5-Aza-CdR粉末使用DMSO溶解,制成濃度為100 mmol·L-1的母液。使用時用PBS或培養(yǎng)基稀釋5-Aza-CdR為濃度1 mmol·L-1,在長至0.6~0.7的HT22細(xì)胞中,與誘導(dǎo)劑一起加至培養(yǎng)基中,使其終濃度為1、5、10 μmol·L-1。培養(yǎng)24 h后常規(guī)收集細(xì)胞,樣品凍于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.6 MTS檢測細(xì)胞活力選取生長狀態(tài)良好的HT22細(xì)胞,將其種于96孔板中,每孔1×103個細(xì)胞,每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h。24 h后,加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化TH22細(xì)胞,每個分組重復(fù)6個復(fù)孔,設(shè)立一個空白孔,只加入100 μL的完全培養(yǎng)基,作為空白對照。培養(yǎng)24 h后取出,每孔加入20 μL的MTS,放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育150 min,取出后使用酶標(biāo)儀490 nm處檢測OD值。

    1.7 Real time RT-PCR將HT22細(xì)胞,待測組織凍于-80 ℃?zhèn)溆?。使用時在冰上融化,每只小鼠的海馬作為一組樣品加入1 mL TRIzol常規(guī)提取各組RNA,測定RNA濃度。每組樣品各取1 μg,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。從每組反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中各取1 μL,利用SYBR GreenⅠ試劑盒進行real time PCR 擴增,PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s;60 ℃ 45 s,72 ℃30 s,共40個循環(huán)。根據(jù)所得各組的CT值,利用2-ΔΔCT計算mRNA相對表達(dá)量[10],實驗重復(fù)3次。

    Tab 1 Primer sequences

    1.8 Western blot將小鼠海馬分離后,待測組織凍于-80 ℃。使用時冰上融化,每只小鼠海馬樣品中加入300 μL的RIPA裂解液,加入蛋白酶抑制劑和磷酸蛋白酶抑制劑,超聲輔助裂解,BCA法測定蛋白濃度。電泳時蛋白上樣量為30 μg,條件恒流15 mA, 接著恒流400 mA轉(zhuǎn)膜過夜,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。室溫,50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h,TTBS 洗膜3次,每次10 min,一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜,TTBS 洗膜3次, 每次10 min,HRP標(biāo)記的驢抗兔二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h,TTBS 洗膜3次,每次10 min,ECL發(fā)光。

    1.9 免疫組織熒光染色將24孔板每個孔中分別放入多聚賴氨酸處理的圓形蓋玻片,將HT22細(xì)胞接種于孔板中,每孔2.5×103個細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后進行誘導(dǎo)和10 μmol·L-15-Aza-CdR處理,24 h后小心棄掉培養(yǎng)基,用PBS洗3遍,加入40 g·L-1的多聚甲醛4 ℃固定過夜;d 2輕輕吸出多聚甲醛, PBS清洗3次,每次5 min;用2 g·L-1Triton X-100通透,室溫下孵育5 min;棄掉通透液,PBS清洗3次,每次5 min;用60 g·L-1BSA室溫封閉30 min;棄掉封閉液,用PBS清洗3次,每次5 min;用10 g·L-1BSA 1 ∶300稀釋一抗,4 ℃孵育過夜;次日取出孔板,復(fù)溫孵育1 h后用BSA-PBS洗滌3次。加入熒光二抗避光室溫孵育4 h;用BSA-PBS洗滌2次,再用去離子水洗1次,浸泡在去離子水中;取出蓋玻片將有細(xì)胞的一面反過來小心扣在滴加DAPI的載玻片上,用指甲油封片。-20 ℃保存,盡快使用激光共聚焦進行掃描和分析熒光強度。

    1.10 質(zhì)粒構(gòu)建和DNA轉(zhuǎn)染TSC1-pcDNA3質(zhì)粒由Nellist博士友情提供[11]。然后,將TSC1亞克隆到EGFP載體中。使用NeroTMTransfection進行TSC1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT22細(xì)胞,使TSC1過表達(dá),將細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染后,將細(xì)胞孵育48 h,然后收集。

    2 結(jié)果

    2.1 5-Aza-CdR降低HT22細(xì)胞的活力用0(作為對照),1、5或10 μmol·L-1,5-Aza-CdR處理HT22細(xì)胞。結(jié)果顯示,10 μmol·L-1的5-Aza-CdR與對照組相比,可以明顯降低HT22細(xì)胞的活力(P<0.01,見Fig 1)。

    Fig 1 Effect of 5-Aza-CdR on cell vitality **P<0.01 vs control

    2.2 5-Aza-CdR促進TSC1 mRNA的表達(dá)Real time RT-PCR的結(jié)果顯示10 μmol·L-1的5-Aza-CR顯著增加了TSC1 mRNA(P<0.01),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。而mTOR和LC3 mRNA在這些濃度下,均未產(chǎn)生任何明顯變化(Fig 2)。結(jié)果提示5-Aza-CdR在mRNA水平上對TSC1可產(chǎn)生影響,而對mTOR和LC3 mRNA的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

    Fig 2 Expression of TSC1, mTOR, LC3 mRNA in HT22 cells **P<0.01 vs control

    2.3 5-Aza-CdR可增加TSC1蛋白的表達(dá),降低p-mTOR的表達(dá),增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例根據(jù)Westren blot的結(jié)果顯示,10 μmol·L-15-Aza-CdR可增加TSC1蛋白(P<0.01),具有統(tǒng)計學(xué)意義;mTOR蛋白表達(dá)則不受5-Aza-CdR的影響,而p-mTOR的表達(dá)降低(P<0.01)。但是在用5 μmol·L-15-Aza-CdR(P<0.05)和10 μmol·L-1(P<0.01)處理的樣品中,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例增加了(Fig 3)。結(jié)果提示5-Aza-CdR可以促進HT22細(xì)胞的自噬,并且TSC1/mTOR通路參與其中。

    2.4 5-Aza-CdR增強小鼠海馬中TSC1蛋白的熒光強度為了進一步檢測5-Aza-CdR在形態(tài)學(xué)對TSC1蛋白的影響,本研究選取有效濃度10 μmol·L-1進行細(xì)胞免疫熒光染色,檢測TSC1表達(dá)水平及其定位(Fig 4)。結(jié)果顯示,5-Aza-CdR組相比對照組TSC1的熒光強度增強,其表達(dá)主要集中在細(xì)胞漿中,從形態(tài)學(xué)上進一步證明5-Aza-CdR促進TSC1蛋白的表達(dá),結(jié)果與Western blot一致。

    Fig 3 Protein expression of TSC1, mTOR, p-mTOR, LC3 in HT22 cells exposed to 5-Aza-CdR n=6)*P<0.05, **P<0.01 vs control

    Fig 4 Immunofluorescence of TSC1 protein in HT22 cells exposed to 5-Aza-CdR(Bar=50 μm)

    2.5 過表達(dá)TSC1抑制p-mTOR,促進LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例增加為了進一步證明TSC1在此過程中起關(guān)鍵性作用,本研究進行TSC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,使其過表達(dá),發(fā)現(xiàn)TSC1過表達(dá)后,mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)降低(P<0.05), LC3-Ⅱ的表達(dá)增加(Fig 5)。

    Fig 5 Effect of TSC1 over-expression on protein expression of mTOR, p-mTOR and LC3 in HT22 cells n=6)*P<0.05, **P<0.01 vs control

    3 討論

    在本研究中,通過體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞HT22檢測自噬標(biāo)記物L(fēng)C3作為自噬的標(biāo)記物,通過LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例衡量細(xì)胞自噬水平。本研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR可通過誘導(dǎo)自噬增加,在此過程中有TSC1/mTOR通路的參與其中。有研究報道5-Aza-CdR可以誘導(dǎo)人慢性粒細(xì)胞自噬[7-8]。因此,推測5-Aza-CdR有可能作為自噬誘導(dǎo)劑而在疾病中發(fā)揮作用??紤]到自噬在腦外傷、腦缺血、衰老等過程中起著重要作用[2,12],探討5-Aza-CdR對神經(jīng)元細(xì)胞自噬的作用可能具有一定的意義。

    為了進一步研究5-Aza-CdR對神經(jīng)細(xì)胞的作用機制。本研究觀察了其對TSC1/mTOR通路的研究。TOR是自噬的主要調(diào)節(jié)機制之一,那么5-Aza-CdR是否通過此通路發(fā)揮作用,鮮有報道。 mTOR是絲氨酸/蘇氨酸激酶,是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinases, PI3K)相關(guān)激酶家族的成員,是細(xì)胞生長,細(xì)胞增殖,凋亡和自噬的重要的調(diào)節(jié)因子[13]。當(dāng)mTOR的活性降低時,將誘導(dǎo)自噬。 Kim等[14]報道,自噬增強劑訶子鞣酸通過抑制mTOR活性對神經(jīng)元細(xì)胞具有神經(jīng)保護作用。與Kim等的結(jié)果類似,本研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR誘導(dǎo)自噬的同時,不會改變mTOR的表達(dá),對p-mTOR(Ser2448)的磷酸化水平被抑制的。TSC1/2在激活mTOR中起關(guān)鍵作用。TSC復(fù)合物可通過充當(dāng)GAP來負(fù)調(diào)控mTOR信號傳導(dǎo)[9]。當(dāng)誘導(dǎo)TSC1時,在鼠神經(jīng)原蟲/脊髓混合細(xì)胞(NSC-34細(xì)胞)中伴隨mTORC1失活[15]。相反,在缺失TSC1的動物模型中,mTOR信號增加了[16]。本研究中5-Aza-CdR增強了mTOR上游的TSC1表達(dá)。因此,推測5-Aza-CdR通過調(diào)節(jié)TSC1啟動子DNA甲基化狀態(tài)使TSC1增加,從而下調(diào)了mTOR活性,致自噬增加。為了證明這些分子之間的關(guān)系,本研究使TSC1在HT22細(xì)胞中過表達(dá),結(jié)果顯示mTOR活性下調(diào)而自噬上調(diào)。

    總之,本研究表明,5-Aza-CdR 增加HT22細(xì)胞自噬并且TSC1/mTOR通路參與其中,為5-Aza-CdR可能是神經(jīng)元自噬的誘導(dǎo)劑增加理論依據(jù),但其作用的機制還需要進一步研究。

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