仙靈脾對(duì)大鼠卵巢中雌孕激素受體和Fas、Bcl－2 的影響

金富銳，陳慧錚

(1.上海國(guó)際和平婦幼保健院，上海 200025;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

下丘腦－垂體功能失調(diào)引起的繼發(fā)性閉經(jīng)是臨床常見的一種閉經(jīng)，其治療方式多采用雌、孕激素周期治療，但部分患者于停藥后仍呈現(xiàn)月經(jīng)異常。有研究認(rèn)為，此時(shí)，采用中西藥聯(lián)合治療可提高治療效果［1］，減少停藥后的再次閉經(jīng)。本研究采用諾雷德建立中樞性閉經(jīng)動(dòng)物模型，用中藥仙靈脾進(jìn)行治療，為本類疾病治療提供一種有效的治療方法。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及給藥方法

性成熟而未生育、體質(zhì)量200g的雌性Wistar大鼠共40只，隨機(jī)分為4組:對(duì)照組、諾雷德組、仙靈脾組、雌激素組，每組各10只。

對(duì)照組:注射生理鹽水0.2ml;諾雷德組:注射諾雷德，0.2ml/只;仙靈脾組:注射諾雷德 0.2ml后，給予仙靈脾(0.2g/天)灌胃28天;雌激素組:注射諾雷德0.2ml后，給予苯甲酸雌二醇(0.072g/d)肌注28天。

第28天處死大鼠，取出卵巢組織，放入4%的多聚甲醛中，梯度酒精脫水后石蠟包埋，放入4℃冰箱待測(cè)。冰凍切片與雜交前預(yù)處理，雜交及雜交信號(hào)檢測(cè)參照試劑盒操作。

1.2 藥物及試劑

諾雷德(英國(guó)阿斯利康制藥公司);仙靈脾(天江中藥);苯甲酸雌二醇(上海信誼制藥);原位雜交試劑盒(北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用F檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定指標(biāo)為陽性目標(biāo)面密度，各組結(jié)果如下。

2.1 雌、孕激素受體水平的變化 見表1。

表1 雌、孕激素受體水平的變化(±s)

表1 雌、孕激素受體水平的變化(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與諾雷得組比較，△P ＜0.05。

卵巢雌激素受體 卵巢孕激素受體對(duì)照組0.166 ±0.036 0.211 ±0.009諾雷德組 0.108 ±0.012* 0.130 ±0.015*雌激素組 0.159±0.032△ 0.145±0.038仙靈脾組 0.162±0.052△ 0.198±0.021△

如表1所示，諾雷德組卵巢雌、孕激素受體水平較對(duì)照組均有下降(P＜0.05);雌激素組和仙靈脾組卵巢雌激素受體均較諾雷德組有顯著增高(P＜0.05);仙靈脾組卵巢組織孕激素受體較諾雷德組有顯著增加(P＜0.05)，雌激素組卵巢孕激素受體較諾雷德組有增高趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 Fas和Bcl－2表達(dá)變化 見表2。

表2 Fas和Bcl－2表達(dá)變化(±s)

表2 Fas和Bcl－2表達(dá)變化(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與諾雷得組比較，△P ＜0.05。

Fas Bcl－2對(duì)照組0.022 ±0.006 0.171 ±0.025諾雷德組 0.033 ±0.002 0.105 ±0.010*雌激素組 0.028 ±0.010 0.129 ±0.033仙靈脾組 0.025±0.009△ 0.153±0.026△

如表2所示，諾雷德組中Fas表達(dá)顯著高于對(duì)照組;仙靈脾組Fas表達(dá)較諾雷德組有顯著降低(P＜0.05)，雌激素組則沒有顯著變化。諾雷德組Bcl－2表達(dá)顯著低于對(duì)照組，仙靈脾組處理后則顯著高于諾雷德組(P＜0.05)，而雌激素組無明顯變化。

3 討論

3.1 動(dòng)物模型的成功建立

諾雷德是一種注射用的促黃體生成素釋放激素類似物，通過負(fù)反饋?zhàn)饔孟虑鹉X，抑制下丘腦產(chǎn)生促性腺激素釋放激素;同時(shí)還能競(jìng)爭(zhēng)性地與垂體細(xì)胞膜上的促性腺激素釋放激素受體或促黃體激素釋放激素受體結(jié)合，阻止垂體產(chǎn)生卵泡刺激素和黃體生成素，從而減少卵巢分泌雌激素。采用諾雷德建立的動(dòng)物模型成功模擬了下丘腦性－垂體性閉經(jīng)，經(jīng)處理后的大鼠失去原有的動(dòng)情周期。動(dòng)物解剖時(shí)可見子宮卵巢的形態(tài)均發(fā)生了萎縮現(xiàn)象。諾雷德動(dòng)物模型的卵巢組織中的雌、孕激素受體均有顯著下降，由于激素受體的含量受垂體激素LH(黃體生成素)和FSH(卵泡刺激素)的調(diào)整，可以推測(cè)諾雷德對(duì)大鼠下丘腦－垂體功能產(chǎn)生抑制作用。

3.2 仙靈脾對(duì)大鼠卵巢組織中雌、孕激素受體的影響

動(dòng)物模型建立成功后，分別采用苯甲酸雌二醇和仙靈脾進(jìn)行治療，治療結(jié)束后檢測(cè)卵巢組織中雌、孕激素受體的含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在卵巢組織中，雌激素組的雌激素受體比諾雷德組有顯著增高，但孕激素受體無明顯變化，仙靈脾組的雌激素受體和孕激素受體較諾雷德組有顯著升高，兩組的雌激素受體無顯著差異。該研究結(jié)果表明，仙靈脾和雌激素都可以修復(fù)卵巢雌激素受體，但只有仙靈脾具有修復(fù)卵巢孕激素受體的效果，因此，仙靈脾的修復(fù)作用更具優(yōu)勢(shì)。既往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)［2］，仙靈脾對(duì)米非司酮處理過大鼠卵巢組織的雌孕激素受體同樣具有修復(fù)作用，但尚無研究探討其對(duì)諾雷德處理過的大鼠卵巢組織是否有修復(fù)作用。

3.3 仙靈脾對(duì)大鼠卵巢組織Fas和Bcl－2表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因Fas和細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl－2都存在于卵巢組織中，對(duì)卵泡發(fā)育發(fā)揮重要作用［3］，諾雷德組大鼠卵巢組織中Fas水平顯著升高，Bcl－2則明顯降低，說明諾雷德通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡對(duì)大鼠卵巢功能產(chǎn)生抑制作用，而通過雌激素治療后的大鼠卵巢組織中細(xì)胞凋亡因子水平?jīng)]有明顯增加，說明雌激素不能通過修復(fù)細(xì)胞凋亡過程達(dá)到修復(fù)卵巢功能的作用，而仙靈脾組的Fas和Bcl－2水平及基本接近正常狀態(tài)，仙靈脾可以通過修復(fù)細(xì)胞凋亡過程修復(fù)卵巢功能。

3.4 仙靈脾對(duì)雌孕激素受體的改善作用

仙靈脾，味甘辛、性溫、入肝腎二經(jīng)，具有補(bǔ)腎、壯陽、祛風(fēng)除濕之功效，李時(shí)珍在《本草綱目》中稱其能“益精氣，堅(jiān)筋骨、補(bǔ)腰膝、強(qiáng)心力，乃手足陽明三焦命門藥也，真陽不足者益之”。其主要成分為黃酮類成分，實(shí)驗(yàn)證明，能促進(jìn)精液分泌、改善免疫系統(tǒng)功能、改善心血管的流量，且在抗衰老、鎮(zhèn)靜、催眠、抗疲勞等方面有作用，能增強(qiáng)下丘腦－垂體－卵巢軸及腎上腺皮質(zhì)軸，胸腺軸等內(nèi)分泌系統(tǒng)的分泌功能［4］。仙靈脾有溫補(bǔ)腎陽之功，使腎氣充足，血海充盈，則經(jīng)自調(diào)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，仙靈脾通過改善卵巢組織中的細(xì)胞凋亡過程修復(fù)卵巢功能，進(jìn)而上調(diào)卵巢組織中雌、孕激素受體的水平。這為臨床實(shí)踐中，采用雌激素和仙靈脾聯(lián)合治療提高療效提供了理論依據(jù)。

5 展望

隨著生活節(jié)奏的加快及社會(huì)的發(fā)展，女性工作壓力不斷增加，大腦皮層處于長(zhǎng)期緊張狀態(tài)，下丘腦功能受到抑制，由此引起月經(jīng)稀發(fā)甚至閉經(jīng)等亞健康狀態(tài)。另外，藥流人流后引起的稀發(fā)月經(jīng)、閉經(jīng)日益增多。臨床上多采用人工周期治療，一般治療周期為3～6個(gè)月，停藥后的月經(jīng)失調(diào)復(fù)發(fā)成為治療該病的難點(diǎn)之一。中醫(yī)藥治療本病的特點(diǎn)是從整體入手，改善人體的狀態(tài)，如果說人工周期治療是治標(biāo)，那么中西醫(yī)聯(lián)合治療應(yīng)該是一種標(biāo)本兼治的好辦法。但中藥治療個(gè)體差異大，用藥方法繁瑣，難以標(biāo)準(zhǔn)化，臨床依從性較差。因此，本研究致力于采用仙靈脾這一傳統(tǒng)中藥的單劑型進(jìn)行治療，仙靈脾具有性激素樣作用，能夠明顯提高性腺對(duì)促性腺激素的反應(yīng)，藥味少，易于堅(jiān)持，長(zhǎng)期應(yīng)用，未見副作用，有深入研究?jī)r(jià)值。一方面，可明顯改善生殖軸的功能，另一方面，改善機(jī)體整體狀態(tài)，為今后治療此種疾病提供理論依據(jù)。

［1］ 巴文君，孫麗萍，張秋菊，等.補(bǔ)骨脂對(duì)初老小鼠體內(nèi)雌孕激素水平作用實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(5):19 －21.

［2］ 金富銳.仙車飲對(duì)RU486處理后大鼠雌孕激素受體的改善作用［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2006，23(2):63 －64.

［3］ 李梅，李志凌，李紅發(fā).多囊卵巢綜合征卵巢小卵泡上凋亡調(diào)控蛋白 Bax、Bcl－2 及 Fas、FasL 的表達(dá)［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2004，20(9):1027－1029.

［4］ 許青媛.淫陽藿對(duì)大鼠性腺功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，1996，12(2):22 －23.