奶粉攝入改善慢性不可預知性應激誘導的小鼠抑郁樣行為

黃佳琪，成杰，朱艷艷，張秉義，朱莎莎，李帆

（1.西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院西安710061；2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院皮膚病科西安710061；3.陜西省商洛市疾病預防控制中心，陜西商洛726000）

0 引 言

隨著現(xiàn)代化生活壓力的增大和節(jié)奏的加快，“抑郁”逐漸成為人們關注的焦點。抑郁情緒嚴重影響個人生活，并導致社會適應障礙，甚至危害自身生命健康[1-2]。抑郁治療可從多方面展開，除常規(guī)的藥物治療外，也可通過飲食調節(jié)的方式來治療[3-4]。一些營養(yǎng)物質可作為輔助治療抑郁癥的手段，與其含有特定維生素、礦物質和其他化學成分有關。如食物中含有的多不飽和脂肪酸、氨基酸、維生素均可改善抑郁[5]。牛奶粉作為一種常見的營養(yǎng)物質，富含多種氨基酸、不飽和脂肪酸等[6]，其中ω-3多不飽和脂肪酸可激活過氧化物酶增殖物激活受體（Peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα）。PPARα作為調控物質代謝、細胞增殖、炎癥反應的轉錄激活因子，廣泛分布于大腦神經元細胞、腦血管內皮細胞，且與學習記憶、抑郁等行為學密切相關[7-9]。血紅素氧合酶（heme oxygenase-1，HO-1）是PPARα的下游靶基因[10-11]，可介導抗氧化和細胞保護作用，對腦神經細胞的保護至關重要，是治療神經系統(tǒng)疾病的重要靶點[12-15]。牛奶粉的攝入對抑郁癥是否具有緩解作用，與PPARα和HO-1的表達是否有關，目前還不明確。因此，本實驗通過慢性不可預知性應激建立小鼠抑郁模型，探究奶粉攝入對小鼠抑郁樣行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

雄性ICR小鼠40只（20-25 g）購于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心，隨機分為空白對照組、抑郁模型組、抗抑郁藥物組和奶粉組，每組10只，實驗已獲得西安交通大學動物倫理委員會審批（No.XJTULAC2019-1259）。全脂奶粉購自天津伊利乳業(yè)有限責任公司；鹽酸氟西汀購自常州四藥制藥有限公司（10 mg/片，H 19980139）；鼠多克隆抗PPARα抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司（美國）；兔多克隆抗HO-1抗體購自Cell Signaling Technology公司（美國）；懸尾測試儀（TST-100）購自成都泰盟軟件有限公司。

1.2 慢性不可預知性應激模型

實驗采用的慢性不可預知性應激包括4℃冰水游泳（3 min）、禁食（12 h）、傾斜鼠籠（12 h）、夾尾（5 min）、慢性束縛（1 h），多種應激隨機安排，每天1種，同種應激不連續(xù)出現(xiàn)，持續(xù)6周。

1.3 動物模型驗證

施加慢性不可預知性應激4周后，利用懸尾測試儀進行懸尾實驗（tail suspension test，TST），檢測小鼠抑郁模型。

1.4 模型處理

奶粉組小鼠每晚20點給予現(xiàn)配牛奶粉（12.5 g全脂奶粉溶于90 mL水），次日早晨8點將奶粉乳液換為飲用水，持續(xù)2周；同時對藥物組小鼠進行鹽酸氟西汀灌胃，灌胃劑量為5 mg/(kg·d-1)，持續(xù)2周。

1.5 Western Blot檢測

取小鼠海馬組織，提取蛋白裂解液，蛋白樣品在10%SDS-PAGE膠中分離，轉至PVDF膜，封閉后孵育一抗和二抗，ECL化學發(fā)光，采用Image J軟件進行灰度值測定。

1.6 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示。統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計學軟件，多組間比較采用one-way ANOVA進行分析，P＜0.05為統(tǒng)計學有差異。

2 結 果

2.1 小鼠體質量與攝食量變化

慢性不可預知性應激在一定程度上可影響小鼠體質量與攝食[16]。如圖1（a）所示，實驗第4周，對照組小鼠體重顯著高于施加慢性不可預知性應激小鼠的體重（P＜0.05），再給予藥物和奶粉2周干預后，藥物組和奶粉組小鼠體重回升，且與對照組無顯著差異，而模型組小鼠體重與對照組仍有顯著差異（P＜0.05）。圖1（b）顯示，慢性不可預知性應激降低小鼠攝食量，給予藥物干預后，藥物組小鼠攝食量增加，與對照組無顯著差異，給予奶粉干預后，奶粉組小鼠攝食量顯著降低（P＜0.05）。奶粉組小鼠常規(guī)飼料攝入減少可能與攝入奶粉乳液后小鼠飲食結構的改變有關。

圖1 各組小鼠體質量與攝食量變化情況

2.2 抑郁模型驗證

給予小鼠慢性不可預知性應激4周后，利用懸尾實驗檢測小鼠抑郁樣行為。如圖2所示，模型組、藥物組、奶粉組小鼠在懸尾實驗中不動時間顯著性高于空白對照組（P＜0.05），提示慢性不可預知性應激可誘導出了小鼠抑郁樣行為，抑郁模型建立。

圖2 小鼠懸尾實驗檢測結果

2.3 奶粉攝入改善小鼠抑郁樣行為

給予小鼠藥物或奶粉乳液2周后，利用懸尾實驗檢測小鼠抑郁樣行為。如圖3所示，模型組小鼠不動時間仍顯著高于空白對照組（P＜0.05），表明小鼠抑郁樣行為仍然存在。與模型組相比，藥物組與奶粉組小鼠懸尾不動時間降低，且有顯著性差異（P＜0.05）。表明抗抑郁藥物可有效改善小鼠抑郁情況，攝入奶粉乳液也可緩解小鼠抑郁樣行為。

圖3 小鼠懸尾實驗檢測

2.4 奶粉攝入對小鼠海馬體形態(tài)結構的影響

對照組小鼠海馬組織CA1區(qū)的椎體細胞排列層數(shù)較多且整齊，模型組椎體細胞較對照組排列散亂。藥物組與奶粉組CA1區(qū)的椎體細胞形態(tài)與對照組無明顯差異，提示奶粉干預對小鼠海馬組織CA1區(qū)椎體細胞形態(tài)有保護作用。

圖4 小鼠海馬體CA1區(qū)HE染色

2.5 奶粉攝入逆轉小鼠海馬體PPARα及HO-1蛋白表達

PPARα和HO-1是影響大腦神經系統(tǒng)的重要轉錄因子，如圖5所示，慢性不可預知性應激降低小鼠海馬體PPARα和HO-1的蛋白表達水平，給予小鼠藥物或奶粉乳液干預后，PPARα和HO-1的蛋白表達水平可被逆轉。

圖5 奶粉攝入逆轉小鼠海馬PPARα及HO-1蛋白水平

3 討 論

抑郁的發(fā)生與腦組織病變密不可分，通過飲食來調節(jié)或治療抑郁已經成為人們關注的熱點。從飲食結構角度而言，不良的飲食結構是多數(shù)抑郁焦慮患者共有的特征，表現(xiàn)為優(yōu)質蛋白和膽固醇等營養(yǎng)成分攝入不足[17-18]。在本實驗中，由于奶粉乳液的攝入，小鼠的常規(guī)攝食量減少，但體重呈回升趨勢，小鼠飲食結構的調整使更多的優(yōu)質蛋白被攝入，對小鼠抑郁樣行為的緩解有促進作用。奶粉中營養(yǎng)物質豐富，有研究顯示牛奶酪蛋白水解肽可以通過血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)，對神經元發(fā)揮保護作用[19-20]。牛奶中豐富的α-乳白蛋白具有舒緩壓力、促進睡眠的作用[21]，而牛奶中的L-色氨酸可用于合成5-HT與褪黑素，促進睡眠[22]，這些都可能是潛在的改善抑郁樣行為的營養(yǎng)物質。實驗中用到的抗抑郁藥物鹽酸氟西汀可明顯改善小鼠的抑郁樣行為，研究表明該藥物主要通過PPARα的表達與激活發(fā)揮作用[23]。在本實驗中，慢性不可預知性應激降低了小鼠海馬區(qū)域PPARα和HO-1的蛋白表達水平，奶粉攝入逆轉小鼠海馬組織PPARα和HO-1表達水平，可能是奶粉緩解抑郁樣行為的重要機制。此外，由于奶粉富含的乳蛋白與乳脂，相對于普通飲用水，其口感更佳，小鼠更偏好奶粉乳液，攝食過程中的愉悅心理以及應激后的食物獎賞機制也是改善抑郁的可能因素[24-25]。

綜上所述，本研究闡釋了奶粉攝入緩解慢性不可預知性應激誘導的小鼠抑郁樣行為，可能與小鼠的飲食結構改變及大腦海馬體PPARα、HO-1蛋白表達水平有關。本研究可為富含營養(yǎng)物質的奶粉治療抑郁提供新的理論依據。