Linc00704對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

陳萍 梁俊榮 汪鑫 李丹秀 王琦 曹田宇 周金池 趙曉迪 盧瑗瑗 王新

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見惡性腫瘤之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡率的第二致死因素，且發(fā)病率和死亡率近年來呈增長趨勢［1］。CRC有手術(shù)、放療、化療和靶向藥物等治療方法，早期患者療效較好，但晚期患者療效并不理想。因此，尋找可用于早期診斷、治療和預(yù)后評估的新型生物學(xué)標(biāo)志物尤為重要［2］。lncRNA（long non-coding RNA）是長度>200 個核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，具有低或無蛋白編碼潛能，可形成多種轉(zhuǎn)錄本，通過與蛋白質(zhì)、染色質(zhì)甚至RNA本身的相互作用調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞功能［3］。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在肝癌、肺癌，包括結(jié)直腸癌等多種腫瘤中異常表達(dá)［4-6］。其中，Linc00704是一種有絲分裂相關(guān)的長非編碼RNA（mitotically-associated lncRNA，MANCR），位于 10號染色體，最長轉(zhuǎn)錄本為1 528 bps，包含4個外顯子。本課題組前期利用三維立體細(xì)胞培養(yǎng)模型培養(yǎng)結(jié)腸癌HCA-7細(xì)胞，用EGFR單抗西妥昔篩選獲得敏感結(jié)腸癌細(xì)胞［7］，且結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)西妥昔單抗處理后經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)Linc00704表達(dá)下降約90%，因此推測Linc00704可能在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討Linc00704對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移等功能的影響，以期為闡明結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

27對配對結(jié)直腸癌組織、癌旁組織樣本均來自空軍軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院。正常永生化人結(jié)腸上皮細(xì)胞系FHC和結(jié)直腸癌細(xì)胞系NCI-H716、SW480、SW48、SW1463、Caco-2、DLD-1、HCT15、RKO 均為本實驗前期保存。反義寡核苷酸（antise oligonucleotide，ASO）序列由廣州銳博生物公司合成。Linc00704過表達(dá)慢病毒由上海吉凱基因公司合成。Linc00704引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。轉(zhuǎn)染試劑HiPerFect、RNA提取試劑盒miRNeasy Mini Kit購自QIAGEN公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒5X PrimeScript RT Master Mix及PCR引物均購自TaKaRa公司；Real-time PCR 試劑 Hieff qPCR SYBR Master Mix（No Rox）購自YEASEN公司；Transwell遷移小室購自Millicell公司；Invasion小室購自CORNING公司；Cell Counting Kit-8購自DOJINDO Laboratories公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%二抗、1%谷氨酰胺（100×）、1%非必需氨基酸溶液的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 5% CO2、37℃，待細(xì)胞匯合至85%～95%時消化傳代。轉(zhuǎn)染ASO序列下調(diào)Linc00704表達(dá)：于6孔板中按每孔50 nmol沉默Linc00704的反義寡核苷酸序列（ASO-Linc00704）或陰性對照、5 μL/孔轉(zhuǎn)染試劑HiPerFect與Opti-MEM培養(yǎng)液制備混懸液轉(zhuǎn)染Caco-2、DLD-1細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞行RT-qPCR檢測驗證Linc00704的轉(zhuǎn)染效率。ASO-Linc00704序列為 5′-CCGAAACTTGCCATTT-3′。轉(zhuǎn)染 ASO 序列后的細(xì)胞系分別命名為陰性對照組（ASO-NC組）、ASO-Linc00704組。感染過表達(dá)慢病毒：6孔板中貼壁細(xì)胞生長約40%時，按細(xì)胞MOI=10計算Linc00704的病毒量，加入含40 μL/mL感染增強(qiáng)液的DMEM培養(yǎng)基，混勻后加入6孔板內(nèi)。72 h后加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，RKO細(xì)胞加入2 μg/mL嘌呤霉素；HCT15細(xì)胞加入5 μg/mL嘌呤霉素，1周后行RT-qPCR檢測以驗證轉(zhuǎn)染效率。感染過表達(dá)慢病毒后各細(xì)胞系分別命名為陰性對照組（NC組）、過表達(dá)Linc00704組（Linc00704組）。

1.3 RT-qPCR檢測結(jié)直腸癌中Linc00704 mRNA的表達(dá)水平

收集結(jié)直腸癌組織及轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說明提取總RNA。分光光度計測定RNA濃度及純度后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，條件為37℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶5 s。反轉(zhuǎn)錄后模板用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 30 s；95 ℃變性 5 s，60 ℃延伸 30 s，40個循環(huán)。Linc00704上游引物為 5′-TGTTGGAGGATACCTGTGCAT-3′，下游引物為5 ′-TGCCATTCCCAGATTGTGGAG-3′；內(nèi)參 GAPDH上游引物為 5′-GCACCGT-CAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物為 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。實驗重復(fù) 3 次。采用 2-△△Ct法計算Linc00704 mRNA的表達(dá)量。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖能力

收集轉(zhuǎn)/感染48 h后的細(xì)胞分別以1 000/孔鋪于6個96孔板中，每組細(xì)胞設(shè)5個復(fù)孔，分別在鋪板后0 d（12h）、1d（24 h）、2 d（48 h）、3 d（72 h）、4 d（96 h）、5 d（120 h）各取1板，并將每孔換成100 μL培養(yǎng)液+10 μL CCK-8試劑的混合液，并取96孔板中的5個空白孔加入上述混合液做空白對照，繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（OD）值。根據(jù)吸光度繪制生長曲線。

1.5 Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力

Transwell遷移實驗：收集轉(zhuǎn)染ASO-Linc00704 48 h后的 Caco-2、DLD-1細(xì)胞及Linc00704過表達(dá)的RKO、HCT15細(xì)胞，重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL。取Transwell小室置入24孔板中，下層加入600 μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，上層加入200 μL上述重懸細(xì)胞，置于孵箱常規(guī)培養(yǎng)，Caco-2、DLD-1細(xì)胞培養(yǎng)22 h后取出，RKO、HCT15細(xì)胞培養(yǎng)52 h后取出，小室用PBS清洗2遍，加入1 mL 95%的乙醇固定5 min，再用PBS洗1次后，加入含有 1 mL的結(jié)晶紫溶液染色5 min，PBS清洗，用濕棉簽輕輕擦去小室內(nèi)貼壁細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取3個視野拍照，計數(shù)所穿出的細(xì)胞。Transwell侵襲實驗：使用Invasion小室，Caco-2、DLD-1細(xì)胞培養(yǎng)24 h后取出，RKO、HCT15細(xì)胞培養(yǎng)100 h后取出，其余步驟同遷移實驗。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistic 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中Linc00704 mRNA的比較采用配對t檢驗方法。結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系Linc00704 mRNA表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析。兩組Linc00704 mRNA表達(dá)水平、遷移、侵襲數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Linc00704在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，相比正常癌旁組織，Linc00704在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯降低（2.393±0.821 vs 15.94±3.989，t=4.103，P＜0.001），見圖 1A。正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系FHC和結(jié)直腸癌細(xì)胞系（RKO、HCT15、NCI-H716、SW480、S W1463、SW48、Caco-2、DLD-1）中有6種細(xì)胞Linc00704表達(dá)水平明顯降低（F=44.750，P＜0.001），見圖 1B。本研究選取 Linc00704表達(dá)水平相對較低的RKO、HCT15及較高的結(jié)直腸癌細(xì)胞系Caco-2、DLD-1進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 Linc00704在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expression of Linc00704 in colorectal cancer tissues and cell lines

2.2 構(gòu)建Linc00704下調(diào)及過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞系

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，在Caco-2、DLD-1細(xì)胞中，ASO-Linc00704組的Linc00704 mRNA相對表達(dá)量均低于 ASO-NC 組（均 P＜0.01）。Caco-2、DLD-1細(xì)胞的沉默效率分別為（73.4±2.2）%、（81.9±3.7）%，見圖 2A～B。在 RKO、HCT15細(xì)胞中，Linc00704組的Linc00704 mRNA相對表達(dá)量均高于NC組（均P＜0.001）。RKO、HCT15細(xì)胞的過表達(dá)效率分別為（1 423 900±71 690）%、（2 574 500±78 770）%，見圖 2C～D。說明構(gòu)建Linc00704下調(diào)及過表達(dá)模型成功，可用于后續(xù)功能實驗。

圖2 沉默Linc00704及過表達(dá)Linc00704細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率Fig.2 Transfection efficiency of silencing or overexpressing Linc00704 cells

2.3 下調(diào)及過表達(dá)Linc00704對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，在Caco-2、DLD-1細(xì)胞中，ASO-NC組與ASO-Linc00704組細(xì)胞的OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.465；P=0.257）。在 RKO 與HCT15細(xì)胞中，NC組與Linc00704組細(xì)胞的OD值比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.334；P=0.490）。見圖3。

圖3 結(jié)直腸癌Caco-2、DLD-1、RKO、HCT15細(xì)胞的生長曲線Fig.3 Growth curves of colorectal cancer Caco-2,DLD-1,RKO and HCT15 cells

2.4 下調(diào)及過表達(dá)Linc00704對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移與侵襲的影響

Transwell遷移及侵襲實驗顯示，在Caco-2、DLD-1細(xì)胞中，ASO-Linc00704組細(xì)胞遷移穿膜數(shù)及細(xì)胞侵襲穿膜數(shù)均較ASO-NC組增多（均P＜0.001），見圖4A～B。在 RKO、HCT15細(xì)胞中，Linc00704組細(xì)胞遷移穿膜數(shù)及細(xì)胞侵襲穿膜數(shù)均較NC組減少（均P＜0.001），見圖 4C～D。

3 討論

圖4 Linc00704對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響Fig.4 Effect of Linc00704 on migration and invasion of colorectal cancer cells

越來越多的研究證實lncRNA可通過參與表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等在細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能過程中發(fā)揮重要作用，也能通過相互作用參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2-3，8-9］，因此 lncRNAs的異常表達(dá)可能是腫瘤發(fā)病的機(jī)制。lncRNAs在結(jié)腸癌靶向治療及生物學(xué)預(yù)測方面同樣具有重要的臨床意義。作為一種lncRNA，Linc00704被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤如乳腺癌、甲狀腺癌、胃癌和肝癌等高表達(dá)，且與惡性表型及不良預(yù)后相關(guān)［10-14］。在乳腺癌中，TRACY 等［12］通過搜索TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)Linc00704低表達(dá)患者的10年生存率較Linc00704高表達(dá)患者明顯降低，與預(yù)后不良相關(guān)。以上研究提示Linc00704可能有促癌作用。本研究檢測Linc00704在CRC癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Linc00704在癌組織中低表達(dá)，檢測8種CRC細(xì)胞系同樣發(fā)現(xiàn)有6種細(xì)胞系的Linc00704表達(dá)較正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系FHC降低，提示Linc00704低表達(dá)與CRC癌變密切相關(guān)，且Linc00704可能發(fā)揮促癌及抑癌的雙重作用。

既往研究報道lncRNA失調(diào)在CRC細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡、干性和基因組不穩(wěn)定性等方面具有重要作用［15］。ZHANG等［11］通過質(zhì)粒過表達(dá)Linc00704后發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲，但對細(xì)胞增殖無明顯影響。YAO等［10］通過質(zhì)粒過表達(dá)Linc00704后發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，并通過下調(diào)miR-101而促進(jìn)胃癌發(fā)生，但未進(jìn)行細(xì)胞遷移及侵襲功能實驗。本研究體外功能實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Linc00704表達(dá)對增殖無明顯影響，但下調(diào)Linc00704表達(dá)可促進(jìn)CRC細(xì)胞遷移及侵襲，而過表達(dá)Linc00704可抑制CRC細(xì)胞的遷移及侵襲，提示Linc00704表達(dá)升高可抑制CRC進(jìn)展，這與其在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞系中低表達(dá)結(jié)果一致，但調(diào)節(jié)CRC生物學(xué)行為的具體機(jī)制尚不清楚。本研究未發(fā)現(xiàn)Linc00704表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的影響，考慮原因為lncRNAs細(xì)胞定位與其功能有關(guān)，亞細(xì)胞定位的差異可能導(dǎo)致其在CRC中的功能不同［16-18］。因此，對于Linc00704的亞細(xì)胞定位仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Linc00704在結(jié)直腸癌細(xì)胞和癌組織中下調(diào)，其過表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，可能是CRC診斷及治療的新靶點(diǎn)，但其作用機(jī)制仍未知，后續(xù)將進(jìn)一步在體內(nèi)驗證其作用。