胃癌患者術(shù)中腹腔沖洗液對脫落胃癌細(xì)胞增殖能力的影響△

雷璐敏，許欣琳

解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心手術(shù)室，北京1000480

國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）數(shù)據(jù)顯示，胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤第5 位，病死率居第3 位。胃癌是中國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病和死亡例數(shù)均約占全世界的50%[1-2]。隨著人口老齡化的加劇，預(yù)測中國胃癌的總發(fā)病例數(shù)還將逐年增加，疾病負(fù)擔(dān)呈上升趨勢[2]。手術(shù)是治療胃癌最直接、最有效的方法之一，然而，手術(shù)操作、用物使用等環(huán)節(jié)往往會提高腫瘤細(xì)胞醫(yī)源性播散的概率，而醫(yī)源性播散是腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的一個(gè)重要原因[3-5]，術(shù)后復(fù)發(fā)給患者帶來巨大疾病創(chuàng)傷和負(fù)擔(dān)。因此，避免和減少手術(shù)中各環(huán)節(jié)造成的醫(yī)源性播散意義重大。臨床實(shí)踐中，在胃癌手術(shù)結(jié)束關(guān)閉腹腔前，采用腹腔沖洗液殺滅游離的胃癌細(xì)胞尤為重要，成為預(yù)防復(fù)發(fā)的最后一道防線。目前臨床對腹腔沖洗液滅瘤效果的研究多是通過顯微鏡觀察胃癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化而間接判斷胃癌細(xì)胞是否具有種植、播散的能力。但是具有完整細(xì)胞形態(tài)的胃癌細(xì)胞是否一定具備種植、播散的能力值得進(jìn)一步的探討研究。因此本研究通過精確的細(xì)胞噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測法探討不同腹腔沖洗液在不同溫度、不同作用時(shí)間點(diǎn)對胃癌細(xì)胞增殖活力的影響效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取胃癌細(xì)胞株MGC-803。試劑：蒸餾水、0.5%碘伏、特級胎牛血清、胰蛋白酶、苯酚紅、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline）、RPMI1640、MTT。儀器：倒置相差顯微鏡、正置熒光顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、離心機(jī)、氣浴恒溫箱、培養(yǎng)瓶、96 孔板、濾器。

1.2 MTT 檢測原理

哺乳動物活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將黃綠色的MTT 降解生成藍(lán)紫色的甲瓚結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能[6]。二甲基亞礬（DMSO）可將細(xì)胞中的甲瓚溶解成紫色，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測定甲瓚的含量可定量測定細(xì)胞活力。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組 實(shí)驗(yàn)分為對照組、蒸餾水組和碘伏組，每組8 個(gè)孔。對照組給予RPMI1640 培養(yǎng)液，蒸餾水組給予蒸餾水，碘伏組給予0.5%碘伏。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇：取凍存管，放入37 ℃水浴中使凍存細(xì)胞融解。將融解的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，加入新鮮的培養(yǎng)基離心兩次，最終移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液，傳代1次后即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞傳代：用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2，飽和濕度，每1～2 天換液1次。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度并鋪板，使待測細(xì)胞密度為1000/孔。37 ℃、5%CO2孵育12 h直至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）。

1.3.3 干預(yù)方法 分組加藥，觀察對照組、蒸餾水組、碘伏組在常溫（37 ℃）和高溫（43 ℃）下1、5、10、15、20、25、30 min 不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力的變化。分組加藥后放置在恒溫箱中，確保每組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)溫度保持恒定狀態(tài)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍攝記錄，隨后進(jìn)行MTT 測定。

1.3.4 MTT 法測定細(xì)胞活力 每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)孵育4 h。孵育完畢后，終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm 處測量各孔的光密度（optical density，OD）值。細(xì)胞活力=（加藥孔OD 值-加藥空白孔OD 值）/（對照孔OD 值-對照空白孔OD 值）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 常溫下各時(shí)間點(diǎn)對照組細(xì)胞活力的比較

常溫下各時(shí)間點(diǎn)對照組細(xì)胞OD 值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），均一性較好。（表1）

表1 常溫下各時(shí)間點(diǎn)對照組細(xì)胞的OD 值（±s）

表1 常溫下各時(shí)間點(diǎn)對照組細(xì)胞的OD 值（±s）

時(shí)間1 min 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min OD值100.00±8.92 100.00±4.81 100.00±4.08 100.00±35.02 100.00±5.67 100.00±12.15 30 min 100.00±18.65

2.2 不同溫度不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞活力的比較

除37 ℃1 min 外，常溫和高溫各時(shí)間點(diǎn)蒸餾水組細(xì)胞OD 值均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）；常溫和高溫各時(shí)間點(diǎn)碘伏組細(xì)胞OD 值均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）；除37 ℃30 min 外，常溫和高溫各時(shí)間點(diǎn)碘伏組細(xì)胞OD 值均明顯低于蒸餾水組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。43 ℃1 min 及25 min 時(shí)對照組細(xì)胞OD 值均明顯高于37 ℃，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）；蒸餾水組43 ℃1、5、10、20 min 時(shí)細(xì)胞OD 值均明顯低于37 ℃，15、25、30 min 時(shí)細(xì)胞OD 值均明顯高于37 ℃，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）；碘伏組43 ℃1、10、15、25 min 時(shí)細(xì)胞OD 值均明顯低于37 ℃，5、20、30 min 時(shí)細(xì)胞OD 值均明顯高于37 ℃，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。（表2）

3 討論

3.1 蒸餾水不同作用時(shí)間對胃癌細(xì)胞增殖活力的影響效果比較

研究報(bào)道，蒸餾水灌洗所形成的低滲作用可以使腫瘤細(xì)胞失去活性[7-8]。在本實(shí)驗(yàn)中，蒸餾水對胃癌細(xì)胞增殖活力有明顯的抑制作用。在37 ℃作用下，隨時(shí)間的延長，胃癌細(xì)胞的生長趨勢明顯減弱，說明蒸餾水的低滲作用在較短的時(shí)間1 min 內(nèi)就能達(dá)到破壞胃癌細(xì)胞形態(tài)的作用，但要達(dá)到100%細(xì)胞生長抑制的目標(biāo)，還需要較長的作用時(shí)間。因此，蒸餾水對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用是有一定時(shí)效性的。在43 ℃作用下，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生長抑制率均優(yōu)于常溫37 ℃，這與陳峻青等[9]的腹腔溫?zé)岬蜐B液滅活腫瘤細(xì)胞的報(bào)道結(jié)果相同，即使浸泡時(shí)間延長到30 min，也不能達(dá)到100%腫瘤細(xì)胞滅活率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Huguet 和Keeling[10]研究結(jié)果近似相近，其研究蒸餾水對結(jié)直腸癌手術(shù)過程中腹腔脫落腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)蒸餾水作用于腫瘤細(xì)胞14 min 可以引起細(xì)胞裂解，30 min 才能達(dá)到完全滅活的效果。有研究者觀察不同作用時(shí)間蒸餾水對腫瘤細(xì)胞的滅活率，結(jié)果顯示15 s 時(shí)腫瘤細(xì)胞滅活率﹥10%，隨著時(shí)間的延長，腫瘤細(xì)胞滅活率逐漸升高，1 min 腫瘤滅活率﹥45%，5 min 腫瘤滅活率﹥95%，10 min 后腫瘤滅活率趨于穩(wěn)定[11]。通過上述3 個(gè)類似研究不難發(fā)現(xiàn)不同學(xué)者認(rèn)為溫?zé)嵴麴s水確實(shí)對腫瘤細(xì)胞有殺傷效力，并且優(yōu)于常溫蒸餾水，但達(dá)到100%腫瘤滅活率的浸泡時(shí)間從10 min 到30 min 不等，存在一定的爭議，分析原因可能與實(shí)驗(yàn)樣本的選取有關(guān)，不同腫瘤細(xì)胞由于其生物特性的不同，對蒸餾水的反應(yīng)時(shí)間不同，另外與實(shí)驗(yàn)方法、觀察指標(biāo)也有關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)43 ℃蒸餾水作用于胃癌細(xì)胞，確實(shí)能夠達(dá)到抑制胃癌細(xì)胞生長的目的，但抑制效果并沒有達(dá)到100%，但能夠發(fā)現(xiàn)蒸餾水滅活腫瘤細(xì)胞需要一定的時(shí)間，并且隨時(shí)間的延長胃癌細(xì)胞生長活力明顯降低。

表2 不同溫度不同時(shí)間各組細(xì)胞OD 值的比較（±s）

表2 不同溫度不同時(shí)間各組細(xì)胞OD 值的比較（±s）

注：a與同時(shí)間本組43 ℃比較，P<0.01；b與同時(shí)間同溫度對照組比較，P<0.01；c與同時(shí)間同溫度蒸餾水組比較，P<0.01

蒸餾水組37 ℃99.31±19.73a 71.64±10.01a b 54.41±5.99a b 50.75±15.94a b 62.71±9.68a b 22.30±4.29a b 4.67±1.04a b碘伏組37 ℃4.95±1.22a b c 2.52±0.22a b c 2.84±0.71a b c 5.49±0.86a b c 3.13±0.77a b c 4.23±0.85a b c 1.89±0.30a b對照組37 ℃100.00±8.92a 100.00±4.81 100.00±4.08 100.00±35.02 100.00±5.67 100.00±12.15a 100.00±18.65時(shí)間1 min 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 43 ℃17.32±3.13 48.75±9.05b 34.83±6.77b 68.34±15.94b 55.39±9.59b 47.79±11.40b 50.87±7.39b 43 ℃3.81±0.85b c 3.30±0.76b c 2.05±0.69b c 3.13±0.57b c 3.30±0.58b c 2.98±0.69b c 3.34±0.51b c 43 ℃161.55±16.58 91.07±17.93 86.67±9.26 112.73±10.25 91.27±6.77 120.62±19.25 111.46±8.10

3.2 碘伏不同作用時(shí)間對胃癌細(xì)胞增殖活力的影響效果比較

本研究結(jié)果表明37 ℃和43 ℃時(shí)碘伏對胃癌細(xì)胞增殖活力抑制作用均較明顯。隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞活力降低，當(dāng)作用時(shí)間達(dá)到10 min，胃癌細(xì)胞的增殖活力明顯降低。這與趙菊梅等[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，碘伏在人體安全使用濃度范圍內(nèi)對胃癌細(xì)胞有較明顯的抑制作用。但并不像Favoulet等[13]實(shí)驗(yàn)中提到的能使腫瘤細(xì)胞全部死亡，分析原因?yàn)樗x的腫瘤細(xì)胞種屬不同，碘伏的作用效果會有所差異。但是本研究中高溫碘伏組在作用時(shí)間超過10 min 后，細(xì)胞活力有所提高，分析其原因：一是碘伏主要是通過破壞細(xì)胞蛋白質(zhì)產(chǎn)生不可逆的凝固作用達(dá)到殺滅胃癌細(xì)胞的目的，蛋白質(zhì)凝固需要一定的時(shí)間，一旦完成蛋白質(zhì)凝固作用，即使延長作用時(shí)間細(xì)胞活力變化不大；二是高溫可能對碘伏有一定的蒸發(fā)作用，隨著時(shí)間的延長，導(dǎo)致碘伏對胃癌細(xì)胞增殖活力抑制作用較前降低。

3.3 蒸餾水與碘伏對胃癌細(xì)胞活力的影響效果比較

在本研究中，兩種腹腔沖洗液對胃癌細(xì)胞生長均有不同程度的抑制作用，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的7 個(gè)不同作用時(shí)間點(diǎn)，碘伏對胃癌細(xì)胞生長的抑制效果均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蒸餾水，提示碘伏通過破壞胃癌細(xì)胞蛋白質(zhì)，使其發(fā)生不可逆凝固所需時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于蒸餾水低滲作用，說明碘伏的胃癌細(xì)胞生長抑制效果優(yōu)于蒸餾水，能有效預(yù)防胃癌細(xì)胞的種植及播散。蒸餾水與碘伏都能達(dá)到抑制胃癌細(xì)胞生長的目的，但值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種腹腔沖洗液在30 min 的作用時(shí)間內(nèi)都不能達(dá)到100%抑制細(xì)胞生長的目的。

術(shù)中腹腔沖洗是減少胃癌腹腔游離腫瘤細(xì)胞種植轉(zhuǎn)移的重要措施。因此，選擇科學(xué)的腹腔沖洗液至關(guān)重要[14]。綜上所述，蒸餾水和碘伏作為腹腔沖洗液可以抑制術(shù)中脫落的胃癌細(xì)胞的生長活力，減小其增殖的可能，從而避免胃癌細(xì)胞種植播散導(dǎo)致的術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)。蒸餾水抑制細(xì)胞生長所需時(shí)間較長不適用于臨床手術(shù)過程中術(shù)野沖洗，會帶來一系列的手術(shù)并發(fā)癥，如麻醉時(shí)間延長、切口暴露時(shí)間延長、患者手術(shù)不耐受等一系列問題。應(yīng)用43 ℃、0.5%碘伏在10 min 的作用時(shí)間下，胃癌細(xì)胞生長活力控制在10%以下，雖沒有達(dá)到零生長，但較為理想。臨床應(yīng)用時(shí)，應(yīng)注意使用碘伏腹腔沖洗時(shí)的溫度、濃度和作用時(shí)間。本研究為科學(xué)選擇腹腔沖洗液，減少胃癌腹腔游離腫瘤細(xì)胞種植轉(zhuǎn)移提供了科學(xué)依據(jù)。