乳腺癌患者來源腫瘤異種移植模型的臨床應(yīng)用與進(jìn)展△

孫衛(wèi)欣，薛婷，尹光浩#

1吉林省前衛(wèi)醫(yī)院藥學(xué)部，長(zhǎng)春130012

2吉林大學(xué)第二醫(yī)院乳腺外科，長(zhǎng)春1300410

1 乳腺癌的治療現(xiàn)狀

全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已經(jīng)成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。近年來，亞洲地區(qū)乳腺癌的發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢(shì)。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展及抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)，乳腺癌患者的生存情況得到顯著改善。但是，TNM 分期為Ⅰ～Ⅲ期的原發(fā)乳腺癌患者的10年復(fù)發(fā)率仍約為5.8%，其中，大多數(shù)患者的復(fù)發(fā)與原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥機(jī)制的產(chǎn)生有關(guān)?？梢?，乳腺癌患者對(duì)抗腫瘤藥物的耐藥問題嚴(yán)重制約著其治療效果。

乳腺癌的異質(zhì)性主要表現(xiàn)在組織學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及治療效果等方面，而此種異質(zhì)性尚不能通過組織病理學(xué)、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)受累數(shù)目及腫瘤標(biāo)志物等臨床相關(guān)參數(shù)得到精確的評(píng)估。乳腺癌在不同個(gè)體中呈高度異質(zhì)性[2]，而很多新技術(shù)、新療法在Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段又到達(dá)了瓶頸期，因此，如何建立更加有效的臨床前模型并推動(dòng)抗腫瘤藥物的研發(fā)成為了現(xiàn)階段乳腺癌領(lǐng)域亟待解決的問題。

目前，普遍提倡通過對(duì)基因組醫(yī)學(xué)和藥物基因組學(xué)的研究為患有相同疾病的不同患者亞群個(gè)體化治療方案的制訂提供更加可靠的理論依據(jù)?；颊邅碓茨[瘤異種移植（patient-derived xenograft，PDX）模型能夠保持其原始樣本的分子異質(zhì)性，為研究出更加有療效的抗腫瘤藥物提供了強(qiáng)有力的工具。PDX 的潛在應(yīng)用非常廣泛，包括新的治療靶點(diǎn)的識(shí)別、最佳治療方案的制訂、化療效果的分析和藥物組合的臨床前評(píng)估，以及生物標(biāo)志物的識(shí)別和新的耐藥機(jī)制的發(fā)現(xiàn)[3]。對(duì)這些特征的探索有利于對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行更深入的研究，使前期實(shí)驗(yàn)更加契合臨床真實(shí)事件[4]。

2 乳腺癌體外模型的建立與優(yōu)化

幾十年來，生物學(xué)家一直采用腫瘤單細(xì)胞層體外培養(yǎng)的方式從培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中提取小鼠異種移植物進(jìn)行生物學(xué)特征的研究[5]。然而，數(shù)據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)與其實(shí)際來源腫瘤的增殖方式存在很大差異。在細(xì)胞傳代的過程中，由于應(yīng)用大量培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)改變和細(xì)胞系污染等事件的情況時(shí)有發(fā)生[6]。此外，連續(xù)細(xì)胞系在代數(shù)增加的同時(shí)，在細(xì)胞表型、細(xì)胞功能以及對(duì)疾病模型的反應(yīng)機(jī)制等方面出現(xiàn)了與原代細(xì)胞完全不同的情況。因此，細(xì)胞系是無法如實(shí)反映符合人類腫瘤微環(huán)境的變化的，特別是在某些通路和疾病功能的研究中，細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)逐漸暴露。細(xì)胞培養(yǎng)模型中基因表達(dá)的模式越來越單一，表明腫瘤一旦從患者體內(nèi)被取出，脫離了正常的生長(zhǎng)環(huán)境，轉(zhuǎn)而在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，其異質(zhì)性就會(huì)消失[2]。在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，選擇性壓力使分化程度最低的細(xì)胞得以生長(zhǎng)，因此，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，大多數(shù)細(xì)胞系已適應(yīng)了體外環(huán)境，產(chǎn)生了與人類不同的異質(zhì)性，在遺傳學(xué)和表型上與其起源細(xì)胞均大有不同[7]。為了更好地構(gòu)建人體腫瘤原本的生長(zhǎng)環(huán)境，盡可能地保留腫瘤自身的特征，人們提出了PDX 模型這一概念。其實(shí)，早期PDX 模型的雛形是通過輻射或激素等干預(yù)方法從大鼠中獲得的人類表皮樣癌。此外，也可通過將人結(jié)直腸癌組織移植至裸鼠身上，利用動(dòng)物模型研究惡性腫瘤。1987 年，加州大學(xué)醫(yī)學(xué)中心在裸鼠中建立了黑色素瘤的異種移植動(dòng)物模型，改善了移植率低的問題。這些移植成功的模型均為抗腫瘤藥物療效的預(yù)測(cè)、靶向藥物的尋找奠定了基礎(chǔ)[8]。

目前，廣泛應(yīng)用于乳腺癌領(lǐng)域的細(xì)胞工具包括人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-435S 和MDA-MB-453 等[9-11]。但是，由于這些細(xì)胞系的無限傳代與培養(yǎng)，其表面的糖蛋白減少，細(xì)胞之間的黏著性降低，一些基因無法正常表達(dá)。

3 乳腺癌體內(nèi)模型

3.1 用于一線基礎(chǔ)研究的動(dòng)物模型

3.1.1 T 淋巴細(xì)胞功能缺陷鼠 目前，BALB/c-nu

裸鼠已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域不可或缺的的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。此小鼠無胸腺，為免疫缺陷鼠，不能產(chǎn)生T細(xì)胞。隨著年齡的增長(zhǎng)，皮膚角質(zhì)層變薄，頭頸部皮膚失去彈性，生長(zhǎng)發(fā)育速度逐漸變慢，雖然B 淋巴細(xì)胞正常，但其免疫功能欠佳。裸鼠自發(fā)腫瘤現(xiàn)象罕見，抵抗力差，容易患病毒性肝炎和肺炎。

3.1.2 B 淋巴細(xì)胞功能缺陷鼠 重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠是自發(fā)性的SCID 突變鼠系，T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的發(fā)育和成熟受到阻礙。但是，SCID 小鼠有正常的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞，其外觀與正常小鼠相同。但是，SCID小鼠免疫器官的重量未達(dá)到正常小鼠的30%。SCID 小鼠是PDX 模型的良好宿主[12]。少數(shù)SCID 小鼠的免疫功能在青年期可出現(xiàn)一定程度的恢復(fù)，這與小鼠的年齡、品系、飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。SCID 小鼠易被感染，在高度潔凈的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）環(huán)境下可存活1 年以上。SCID 小鼠自發(fā)性T 細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病率為15%左右，起源于胸腺，并可發(fā)生多部位轉(zhuǎn)移。

非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷（non-obese diabetes/severe combined immunodeficiency，NODSCID）小鼠是基于SCID 小鼠而研發(fā)出的免疫缺陷鼠[13]。與SCID 鼠相比，其NK 細(xì)胞的活性較低，免疫恢復(fù)的概率更低。SCID 突變基因的純合影響了T、B 淋巴細(xì)胞的正常發(fā)育。NOD-SCID 小鼠既存在先天免疫缺陷，又缺乏T、B 淋巴細(xì)胞，適用于各種腫瘤組織的移植。但是，NOD-SCID 小鼠更易發(fā)生淋巴瘤，且存活時(shí)間較短。

3.1.3 重度免疫缺陷鼠 近年來，在NOD-SCID 小鼠的背景下敲除白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）受體基因得到了NSG 小鼠。與其他免疫缺陷鼠相比，NSG 小鼠的移植成功率最高，能夠接受更多的移植物。值得注意的是，NSG 小鼠還能實(shí)現(xiàn)人類免疫系統(tǒng)的重建，植入人類造血干細(xì)胞后，NSG 小鼠的外周淋巴組織可以產(chǎn)生人類T 細(xì)胞。

3.1.4 B、T 淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞功能缺陷鼠Beige（bg）小鼠是細(xì)胞活性缺陷的突變系小鼠，該品系為SCID 和Beige 基因突變小鼠。該小鼠的特點(diǎn)為自然殺傷細(xì)胞發(fā)育和功能缺陷，巨噬細(xì)胞活性降低，免疫抗腫瘤殺傷作用出現(xiàn)的時(shí)間較遲，細(xì)胞毒性T 細(xì)胞功能缺乏，體液免疫減弱。該品系適用于免疫學(xué)研究，尤其是各種致病因子的應(yīng)用，但需要達(dá)到SPF 級(jí)小鼠培養(yǎng)的環(huán)境要求。

3.2 PDX 建立方法

3.2.1 組織移植 建立PDX 模型的常用方法是提取患者的腫瘤組織并移植在免疫缺陷鼠皮下。首先通過手術(shù)或活檢收集患者的原發(fā)腫瘤組織，將其用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3 次，然后將無菌培養(yǎng)皿置于冰上，于培養(yǎng)皿中切成﹤1 mm3大小的塊狀。麻醉免疫缺陷小鼠，使用眼科剪剪開約0.5 cm 切口，使用器械將筋膜與皮膚分開，然后將腫瘤組織放入小鼠乳腺相應(yīng)的部位。這些處于移植階段的小鼠稱為F1 小鼠。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)并達(dá)到直徑約1.5 cm 時(shí)，將F1 鼠的腫瘤組織移植到另一只免疫缺陷鼠上，方法同F(xiàn)1 移植過程，處于該擴(kuò)增期的小鼠稱為F2 小鼠。觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100～150 mm3時(shí)，腫瘤組織可用于下游應(yīng)用[14]。

3.2.2 細(xì)胞懸液移植 細(xì)胞懸液移植指的是注射細(xì)胞懸液于移植部位，具體方法：將組織剪碎成大小為1～2 mm3的小塊，將組織研至勻漿；沖洗并收集細(xì)胞懸液，濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，離心沉淀，充分沖洗細(xì)胞后，用注射器吸取帶有基質(zhì)膠的腫瘤細(xì)胞，并注射入皮下，其他步驟同上[15]。

3.3 體內(nèi)模型建立的影響因素

移植腫瘤時(shí)，腫瘤組織塊的大小與腫瘤細(xì)胞的成活率關(guān)系密切，組織塊過大會(huì)阻礙腫瘤細(xì)胞與生長(zhǎng)環(huán)境的結(jié)合。同時(shí)，應(yīng)確保腫瘤組織的活力，避免移植入無效的腫瘤組織[16]。基質(zhì)膠可為腫瘤細(xì)胞起到提供營(yíng)養(yǎng)、聚集細(xì)胞的作用[17]。因此，在移植過程中加入基質(zhì)膠會(huì)提高移植的成功率[18]。

腫瘤細(xì)胞離體的時(shí)間對(duì)于移植的成功率亦具有重要影響。由于腫瘤組織離體后會(huì)處于缺血、缺氧的狀態(tài)，因此，會(huì)對(duì)組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育不利，進(jìn)而影響PDX 模型移植的成功率。因此，將腫瘤細(xì)胞收集后種植到小鼠皮下的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般應(yīng)在2～3 h 內(nèi)完成，并且需要外科醫(yī)師與研究者密切配合。

4 PDX 的優(yōu)勢(shì)與不足

4.1 優(yōu)勢(shì)

經(jīng)過長(zhǎng)期的體外培養(yǎng)，傳統(tǒng)細(xì)胞系移植模型（cell-derived xenograft，CDX）的腫瘤細(xì)胞逐漸適應(yīng)了外環(huán)境，喪失了異質(zhì)性，獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨于同質(zhì)化[19]。然而，PDX 模型中，移植的標(biāo)本來自人體腫瘤組織，充分保留了腫瘤間質(zhì)和細(xì)胞成分，使腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境更接近原發(fā)瘤；通過患者自身的腫瘤組織構(gòu)建的PDX 模型能夠反映個(gè)體的差異，更接近患者的實(shí)際情況[20]，有助于研發(fā)出針對(duì)個(gè)體的抗腫瘤藥物和檢測(cè)出自身特有的生物標(biāo)志物；收集的標(biāo)本也可為今后的研究提供大量的參考。未經(jīng)過體外培養(yǎng)的PDX 模型穩(wěn)定地保留了原發(fā)瘤的遺傳特性、組織學(xué)和表型特征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示臨床預(yù)見性更好[21-22]，通過腫瘤標(biāo)志物評(píng)估腫瘤情況，可用于測(cè)試抗腫瘤藥物的敏感性和預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，實(shí)現(xiàn)腫瘤的個(gè)體化治療。

4.2 不足

各種數(shù)據(jù)及分析均表明PDX 模型的建立比長(zhǎng)期建立的細(xì)胞系和標(biāo)準(zhǔn)異種移植物更符合臨床惡性腫瘤的表型，但是，PDX 模型并未廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中，主要存在以下影響因素[23]。

成本是PDX 模型未廣泛應(yīng)用于臨床的一個(gè)主要問題。為了得到有效的結(jié)果，每個(gè)樣本需要移植大量的受體鼠，同時(shí)，腫瘤移植物僅能在小鼠體內(nèi)維持，與單純維持培養(yǎng)細(xì)胞株相比，其培養(yǎng)及傳代需要更潔凈的培養(yǎng)環(huán)境及專業(yè)的技能，大大增加了成本。另外，制模周期過長(zhǎng)，一般需觀察3～6個(gè)月才能決定模型是否成功[24]。由于人和鼠為不同的物種，因此，物種間的差異依然會(huì)存在。小鼠的環(huán)境會(huì)逐漸取代原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)環(huán)境。腫瘤組織在小鼠體內(nèi)傳代過程中的一些不可控因素也可能導(dǎo)致個(gè)別基因的改變而無法準(zhǔn)確反映患者的病情。

由于PDX 模型的構(gòu)建需要免疫缺陷動(dòng)物，而對(duì)免疫調(diào)節(jié)藥物或通過免疫功能激活的藥物研究就會(huì)限制此種模型的應(yīng)用[25]。乳腺癌PDX 模型的成功率較低又是當(dāng)前研究面臨的一個(gè)影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的重要因素，為了提高PDX 模型的成功率，移植過程中需要注意以下問題：①腫瘤自身因素，與其他腫瘤相比，乳腺癌和前列腺癌PDX 模型建模更難。主要由于這兩種疾病的發(fā)生與激素水平有關(guān)。②實(shí)驗(yàn)用鼠多為重度免疫缺陷小鼠。這些小鼠的免疫缺陷程度較高，可以保證相對(duì)較高的移植成功率，但也會(huì)為其他腫瘤的發(fā)生提供可能。③為了保證移植腫瘤的質(zhì)量，需要有經(jīng)驗(yàn)的外科醫(yī)師判斷提取的是腫瘤細(xì)胞且無壞死組織。

5 小結(jié)與展望

近年來，關(guān)于PDX 模型應(yīng)用于乳腺癌的研究越來越多，Ramani 等[26]通過應(yīng)用三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）患者的PDX 模型對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，PDX 腫瘤模型對(duì)于研究TNBC 具有重要意義。此外，Rosato 等[27]通過檢測(cè)人源化抗程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）單克隆抗體研究TNBC 患者PDX 模型的體內(nèi)活性，結(jié)果顯示，抗PD-1 抗體可顯著抑制部分PDX 腫瘤株的生長(zhǎng)，并提高患者的生存率，表明PDX 模型在乳腺癌藥物的篩選中起到重要的作用，且應(yīng)用前景廣泛。

乳腺癌PDX 模型保存了原發(fā)腫瘤的分子特性、遺傳性和異質(zhì)性，為檢測(cè)和比較不同抗腫瘤藥物治療效果提供了高效、可靠的工具，有望進(jìn)一步推動(dòng)乳腺癌臨床治療方案的優(yōu)化與革新[28]。

PDX 模型優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞系異種移植模型，主要由于其與親代腫瘤有更多的相似之處[29]。目前，PDX 模型作為惡性腫瘤研究的可靠臨床前模型越來越被研究者們接受[30]，其維持了供體腫瘤的生物學(xué)特性，具有良好的臨床預(yù)測(cè)性。就目前的情況及數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示，通過PDX 模型實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療還未達(dá)到實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，仍處于臨床驗(yàn)證階段。因此，迫切需要更好、更具有臨床預(yù)測(cè)性的人類惡性腫瘤模型。有研究發(fā)現(xiàn)了另一種能反映人類惡性腫瘤的模型——人源腫瘤類器官模型（patient-derived organoid，PDO），研究者從人體中提取多能干細(xì)胞，通過短暫地低滲裂解紅細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量和生存能力。通過給予基質(zhì)膠等進(jìn)行極小的刺激，從而促進(jìn)其分化，并任其自由生長(zhǎng)。這些細(xì)胞會(huì)自動(dòng)根據(jù)種類分開，并排列成特定的空間構(gòu)型，經(jīng)過幾個(gè)月的培養(yǎng)，長(zhǎng)成類似于人體器官結(jié)構(gòu)的“類器官”[31]。經(jīng)腫瘤組織培養(yǎng)出的“類器官”未來能夠更好地反映腫瘤的特點(diǎn)，可用于藥物反應(yīng)性試驗(yàn)等研究。無論P(yáng)DX 模型還是PDO 模型，都是通過改變動(dòng)物模型的條件形成符合人類的腫瘤微環(huán)境，以對(duì)人類最小的損傷達(dá)到臨床最佳的效果。這些嘗試對(duì)乳腺癌新藥的研發(fā)及作用機(jī)制的研究均具有重要意義[32]，進(jìn)一步推進(jìn)了乳腺癌個(gè)體化治療的進(jìn)程，并促進(jìn)其研究結(jié)果向臨床轉(zhuǎn)化。