基于氣相-離子遷移譜技術(shù)快速鑒定黃酒酒齡及品牌

顧 雙 任 芳 韋真博 張振方 王本友 朱璐藝 王 俊*

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州310058 2 濟(jì)南海能儀器股份有限公司 濟(jì)南251500）

黃酒是中華民族傳統(tǒng)的釀造酒，與啤酒、葡萄酒并稱為“世界三大古酒”[1]。黃酒是一種以稻米為原料釀造成的糧食酒，不經(jīng)過蒸餾工序，酒精含量低于20%[2]。因其酒精度低，又具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而深受消費(fèi)者青睞。由于黃酒的風(fēng)味和質(zhì)量隨著貯藏年份的增加而提高，因此黃酒行業(yè)內(nèi)常以酒齡來(lái)評(píng)定黃酒的品質(zhì)好壞[3-4]。然而，市售黃酒中常存在生產(chǎn)加工過程中偷工減料，虛報(bào)酒齡及產(chǎn)地等現(xiàn)象，擾亂了黃酒市場(chǎng)，嚴(yán)重影響了黃酒的聲譽(yù)，因此亟待找到一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)黃酒酒齡及產(chǎn)地的方法。

黃酒酒齡及產(chǎn)地分析一般通過感官品評(píng)來(lái)進(jìn)行，此方法必須由經(jīng)過訓(xùn)練和有經(jīng)驗(yàn)的評(píng)酒師評(píng)定[5]，并且易受外界主觀因素的影響[6]。為了得到更精確的結(jié)果，目前常采用高效液相色譜[7]、氣相質(zhì)譜和色譜聯(lián)用[8]、毛細(xì)管[9]和電感耦合等離子質(zhì)譜[10]等分析技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法來(lái)進(jìn)行定性、定量分析，所得試驗(yàn)結(jié)果精確，然而儀器操作過程復(fù)雜，分析時(shí)間長(zhǎng)，不利于樣品的快速分析。

離子遷移譜（IMS）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種氣相快速分離檢測(cè)技術(shù)，其基本工作原理是通過氣態(tài)離子的遷移率來(lái)表征各種不同的化學(xué)物質(zhì)，以達(dá)到對(duì)各種物質(zhì)分析檢測(cè)的目的[11]。IMS 系統(tǒng)的核心部分是遷移管，遷移管分為電離區(qū)和遷移區(qū)2 部分，中間以離子門分隔開。樣品由載氣帶入電離反應(yīng)區(qū)后，載氣分子和樣品分子在離子源的作用下發(fā)生一系列電離反應(yīng)，形成各種產(chǎn)物離子。在電場(chǎng)驅(qū)使下，離子通過周期性開啟的離子門進(jìn)入漂移區(qū)，與逆流的中性漂移氣體分子不斷碰撞并損失能量，產(chǎn)生各自不同的遷移速率，使得不同的離子到達(dá)探測(cè)器上的時(shí)間不同而得到分離。IMS技術(shù)以前大多應(yīng)用于化學(xué)毒劑、毒品和爆炸物的分析檢測(cè)，由于其應(yīng)用領(lǐng)域的敏感性，有關(guān)IMS 報(bào)道較少[12]。近年來(lái)由于其具有無(wú)需樣品前處理、耗時(shí)短和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外開始得到關(guān)注。研究人員發(fā)現(xiàn)由高靈敏度的IMS 技術(shù)和強(qiáng)分辨力的氣相色譜（GC）技術(shù)結(jié)合形成的GC-IMS 技術(shù)，不僅可增強(qiáng)GC 的檢測(cè)靈敏度，還可以提高IMS的分辨率和線性響應(yīng)范圍，是一項(xiàng)高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)。例如，葛含光等[13]采用氣相色譜-離子遷移譜法檢測(cè)出白酒中4種風(fēng)味化合物的含量為正庚酸3.6 mg/L，正辛酸2.1 mg/L，己酸丁酯1.7 mg/L，月桂酸乙酯4.2 mg/L；Gallegos等[14]發(fā)現(xiàn)采用氣相色譜-離子遷移譜法結(jié)合主成分分析能夠有效識(shí)別并區(qū)分乳酸菌的4種菌株；Gerhardt等[15]采用GC-IMS 技術(shù)鑒定橄欖油產(chǎn)地，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法能有效區(qū)分不同產(chǎn)地的橄欖油樣品，并且成分復(fù)雜的樣品也能獲得高分辨率的三維指紋圖譜。至今，將GC-IMS 技術(shù)應(yīng)用于食品品質(zhì)檢測(cè)的報(bào)道并不多，更未見GC-IMS 技術(shù)應(yīng)用于黃酒酒齡的快速檢測(cè)。本文采用GC-IMS 技術(shù)并結(jié)合主成分分析鑒定黃酒不同酒齡及品牌，以期為黃酒的不同酒齡及產(chǎn)地檢測(cè)提供一種快速精確的方法。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

黃酒：1）同一品牌不同標(biāo)注酒齡：3，5，8，10年和20年古越龍山；2）同一標(biāo)注酒齡不同品牌：5年標(biāo)注酒齡的古越龍山、塔牌和會(huì)稽山。所有黃酒樣品均購(gòu)自杭州沃爾瑪超市。

儀器：Flavour SpecR氣相色譜-離子遷移譜儀，德國(guó)GAS 公司。

1.2 樣品處理

取1 mL 黃酒樣品于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中密封，在室溫條件下經(jīng)頂空進(jìn)樣，采用氣相離子遷移譜儀進(jìn)行測(cè)定，每種樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3 GC-IMS 條件

自動(dòng)頂空進(jìn)樣器：進(jìn)樣體積100 μL，孵化時(shí)間20 min，孵化溫度40 ℃，總分析時(shí)間為20 min。色譜柱：集成毛細(xì)管柱MCC-OV-5；載氣/漂流氣：高純氮?dú)猓?9.999%）；流速：2.0 mL/min；離子遷移管溫度：40 ℃；進(jìn)樣器溫度：80 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

黃酒的氣相離子遷移譜采用LAV 2.000 進(jìn)行分析。色度分析采用Photoshop 軟件吸取指紋圖中5 個(gè)已經(jīng)鑒定成分的每個(gè)圓斑中心點(diǎn)和圓斑上下左右方向的半徑中間點(diǎn)的顏色，取平均值。PCA 主成分分析和制圖采用SPSS 18.0 和Origin 8.0 進(jìn)行，顯著性差異采用SPSS 18.0 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒氣相離子遷移譜

圖1 不同標(biāo)注酒齡的古越龍山黃酒氣相離子遷移譜對(duì)比圖Fig.1 Ion mobility spectrum of Guyuelongshan Chinese rice wine samples of various marking age analyzed by GC-IMS

本試驗(yàn)采用GC-IMS 分析了不同標(biāo)注酒齡及不同品牌黃酒的揮發(fā)性成分，結(jié)果如圖1 和圖2所示。圖譜背景為藍(lán)色，顏色越紅代表該物質(zhì)含量越高。GC-IMS 早期離子漂移時(shí)間1.0 ms 處的第1條紅色豎線是水的反應(yīng)離子峰（RIP），形成原因是頂空進(jìn)樣氣體中含有水蒸氣，IMS 放射性氚（3H）電離源產(chǎn)生的能量電子發(fā)生了氣相反應(yīng)，使質(zhì)子化的水分子和氫離子聚集形成水分子。當(dāng)揮發(fā)性化合物成分存在于IMS 的電離區(qū)域時(shí)，水的RIP強(qiáng)度就會(huì)降低或消失，這與Erickson等[16]報(bào)道一致。GC-IMS 早期離子漂移時(shí)間1.0 ms 處的第2條紅色豎線是乙醇?xì)埩?，由于黃酒中乙醇含量較大，并且試驗(yàn)所用色譜柱為SE54 弱極性色譜柱，導(dǎo)致乙醇在色譜柱中殘留較多。由圖1 和圖2所示的揮發(fā)物分布情況可知，不同標(biāo)注酒齡及品種的黃酒顯示出不同的亮度。有些揮發(fā)物是以質(zhì)子鍵合單體或二倍體形式出現(xiàn)的，Borsdorf等[17]詳細(xì)解釋了二聚體形成的原因。在沒有進(jìn)行物質(zhì)定性前，無(wú)法確定GC-IMS 離子遷移圖中可見的各斑點(diǎn)狀化合物具體成分。

圖2 不同品牌5年標(biāo)注酒齡黃酒氣相離子遷移譜對(duì)比圖Fig.2 Ion mobility spectrum of 5-year marking age Chinese rice wine samples of different company brands analyzed by GC-IMS

2.2 黃酒樣品揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜分析

根據(jù)現(xiàn)有的2014 NIST 數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS 數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定圖譜中5種揮發(fā)性有機(jī)物，分別是二甲基二硫、乙酸乙酯、苯甲醛、乙酸異戊酯和丁酮。由圖3可知，不同標(biāo)注酒齡的古越龍山揮發(fā)性有機(jī)物中二甲基二硫和乙酸乙酯含量沒有明顯差異，而苯甲醛、乙酸異戊酯和丁酮含量有較大差異。8～20年黃酒的苯甲醛、乙酸異戊酯和丁酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于3～5年黃酒，而8年和20年黃酒中苯甲醛、乙酸異戊酯和丁酮的含量差異較小，這些肉眼可見的差異可以快速判斷3～5年與8～20年黃酒的年份差異。3～5年黃酒的25，28，29，30 號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于8～20年黃酒，5年黃酒的6 號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)含量最高。3年黃酒的9 和10 號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)含量顯著低于5～20年黃酒，3～5年黃酒的16，19，34，41 號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)含量與8～20年黃酒類似，肉眼觀察不到顯著差異。3～5年黃酒的1～5，7～9，11～14，17，18，20～22，24，26，27，31，33，35～39號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于8～20年黃酒，說(shuō)明8～20年黃酒的揮發(fā)性物質(zhì)含量明顯高于3～5年黃酒。10年黃酒的部分揮發(fā)性物質(zhì)含量明顯少于8年和20年黃酒。一般酒齡越長(zhǎng)，酒中揮發(fā)性物質(zhì)積累越多。然而標(biāo)注酒齡不同于真實(shí)酒齡，其以勾兌酒酒齡的加權(quán)平均計(jì)算，該10年黃酒所用勾兌酒可能與其它標(biāo)注酒齡的黃酒不同。

由圖4可知，3種品牌的黃酒中，乙酸乙酯含量相似，沒有明顯差異。二甲基二硫含量最高的黃酒為古越龍山；苯甲醛和丁酮含量最高的黃酒為塔牌，古越龍山均次之；乙酸異戊酯含量最高的黃酒為會(huì)稽山，其次是塔牌，這些差異可以快速判定不同品牌的5年標(biāo)注酒齡黃酒。塔牌黃酒的1，3，13，15，17，18，20，22 ～24，26，31，32，40號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)含量最高；古越龍山的6，9，10 號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)的含量最高；會(huì)稽山的4，19，27，38，39 號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)的含量最高，3種黃酒的8，16，26，37，41 號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)的含量都高。而古越龍山的5，11，12，14，21，33，35，36 號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)的含量最少；塔牌的28，29 號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)的含量最少；會(huì)嵇山的2號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)的含量最少。以上說(shuō)明5年塔牌黃酒的揮發(fā)性物質(zhì)含量高于另外2種同齡黃酒。

圖3 不同標(biāo)注酒齡古越龍山黃酒揮發(fā)物指紋圖譜Fig.3 Volatile organic compounds fingerprints of Guyuelongshan Chinese rice wine of various marking age analyzed by GC-IMS

2.3 黃酒樣品5種揮發(fā)性有機(jī)物色度角分析

通過Photoshop 軟件對(duì)GC-IMS 軟件生成的指紋圖譜進(jìn)行色度角數(shù)值提取并做圖，結(jié)果如圖5所示。由圖5a可知，8～20年古越龍山黃酒的苯甲醛、乙酸異戊酯和丁酮的H 值均很低，說(shuō)明其含量很高，而3～5年黃酒的含量與之相反。3～5年黃酒的乙酸異戊酯和丁酮H 值在180～220 之間（青色和藍(lán)色），而8～20年黃酒的乙酸異戊酯和丁酮H 值在20～72 之間（橙紅色和黃色），區(qū)別非常明顯。3年和5年黃酒苯甲醛的色度角數(shù)值有顯著差異，3年黃酒的苯甲醛H 值為181.7（青藍(lán)色），而5年黃酒的苯甲醛H 值為95.4（綠色），可以明顯區(qū)分3年和5年黃酒，并且根據(jù)乙酸異戊酯H 值也可以區(qū)別3年和5年黃酒。8～20年黃酒的二甲基二硫和丁酮H 值分別處于16～42 和15～58（紅色、橙色和黃色）范圍內(nèi)，說(shuō)明其含量較高，并且20年黃酒的二甲基二硫和丁酮的H 值最低，分別為16.5 和15.6（紅色），說(shuō)明其含量最高，其次是8年黃酒。

由圖5b可知，3種品牌黃酒中，塔牌黃酒的苯甲醛H 值最低為21.8（橙紅色），其次是會(huì)稽山為55.1（黃色），而古越龍山的苯甲醛H 值最高為95.4（綠色）。塔牌的丁酮H 值最低為24.3（橙紅色），會(huì)稽山和古越龍山的H 值分別為191.7（青藍(lán)色）和181.2（青藍(lán)色）。古越龍山的二甲基二硫的H 值為23.5（橙紅色），低于塔牌的H 值47.7（橙黃色）和會(huì)稽山的H 值55.2（黃色）。會(huì)稽山的乙酸異戊酯H 值最低為32.2（橙紅色），其次是塔牌的H 值61.1（黃綠色），古越龍山的H 值最高為195.6（青藍(lán)色）。上述結(jié)果說(shuō)明塔牌的苯甲醛和丁酮含量最高，古越龍山的二甲基二硫和會(huì)稽山的乙酸異戊酯含量高，3種黃酒的乙酸乙酯含量沒有顯著差異。

2.4 5種揮發(fā)性成分的信號(hào)峰強(qiáng)度變化

通過LAV 軟件分析處理得到黃酒揮發(fā)性物質(zhì)的信號(hào)峰強(qiáng)度值及相對(duì)強(qiáng)度值，如圖6 和圖7所示。由圖6a可知，5種不同酒齡古越龍山黃酒的乙酸乙酯峰強(qiáng)度均最大，由于5年、8年和10年黃酒標(biāo)準(zhǔn)誤差較大，所以3～20年黃酒的乙酸乙酯含量沒有顯著差異。20年黃酒的丁酮峰強(qiáng)度最大，8年黃酒的丁酮峰強(qiáng)度第二，8～20年黃酒的丁酮含量均顯著高于3～5年黃酒，并且8年、10年和20年黃酒的丁酮含量呈現(xiàn)顯著性差異。5種不同酒齡黃酒的二甲基二硫、苯甲醛和乙酸異戊酯峰強(qiáng)度均較小，說(shuō)明古越龍山黃酒中這3種物質(zhì)含量較少。3～20年黃酒的二甲基二硫含量沒有顯著性差異，8～20年黃酒的苯甲醛和乙酸異戊酯峰強(qiáng)度均顯著高于3～5年黃酒。

由圖6b可知，不同品牌黃酒中乙酸乙酯的峰強(qiáng)度均最高，相互之間沒有顯著差異。黃酒中含有較多的乙酸乙酯[18]，其次是丁酮。塔牌的丁酮含量顯著高于古越龍山，而古越龍山的丁酮含量顯著高于會(huì)稽山。不同品牌黃酒中二甲基二硫、苯甲醛和乙酸異戊酯峰強(qiáng)度均較小，并且3種酒的二甲基二硫峰強(qiáng)度差異較小。會(huì)稽山黃酒的乙酸異戊酯含量高于塔牌，而塔牌的乙酸異戊酯含量高于古越龍山。塔牌黃酒的苯甲醛峰強(qiáng)度最高，其次是古越龍山，會(huì)稽山最小。

由圖7a可知，20年古越龍山黃酒中5種揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)峰強(qiáng)度都接近最高值，均在97%以上。8年黃酒次之，5種物質(zhì)相對(duì)強(qiáng)度也都很高，均在85%以上。10年黃酒中5種物質(zhì)相對(duì)峰強(qiáng)度稍低于8年黃酒，但5種物質(zhì)也都很高，除乙酸異戊酯相對(duì)峰強(qiáng)度為68%，其它均在80%以上。3年和5年黃酒只有二甲基二硫和乙酸乙酯的相對(duì)峰強(qiáng)度很高，達(dá)到90%以上，而苯甲醛的相對(duì)峰強(qiáng)度分別62.3%和60%，乙酸異戊酯和丁酮相對(duì)峰強(qiáng)度均低于50%。不同酒齡黃酒的二甲基二硫和乙酸乙酯相對(duì)峰強(qiáng)度差異較小，而苯甲醛、乙酸異戊酯和丁酮有顯著差異，這3種揮發(fā)性物質(zhì)可用來(lái)快速檢測(cè)不同齡的古越龍山黃酒。

由圖7b可知，在不同品牌黃酒中，塔牌黃酒的5種揮發(fā)物中乙酸異戊酯相對(duì)峰強(qiáng)度較小為75.6%，會(huì)稽山黃酒的苯甲醛和丁酮相對(duì)峰強(qiáng)度較小，分別為44.7%和43.3%，古越龍山黃酒的苯甲醛和丁酮相對(duì)峰強(qiáng)度均為70.6%，乙酸異戊酯相對(duì)峰強(qiáng)度只有48.7%。3種黃酒的二甲基二硫和乙酸乙酯相對(duì)峰強(qiáng)度都較高，均達(dá)80%以上，且3種不同品牌的黃酒中苯甲醛、乙酸異戊酯和丁酮的相對(duì)峰強(qiáng)度差異較大，說(shuō)明通過該方法能快速區(qū)分古越龍山、塔牌和會(huì)稽山黃酒。

圖7 不同標(biāo)注酒齡古越龍山黃酒和不同品牌5年標(biāo)注酒齡黃酒的5種物質(zhì)相對(duì)峰強(qiáng)度變化Fig.7 Changes of relative peak intensities of 5 substances on Guyuelongshan Chinese rice wine samples of various marking age and 5-year marking age Chinese rice wine samples of different company brands

2.5 不同品牌及酒齡黃酒揮發(fā)性物質(zhì)的主成分分析

對(duì)5種標(biāo)注酒齡的古越龍山黃酒和不同品牌的5年陳釀黃酒的強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，以達(dá)到降維的目的。圖8a是5種不同標(biāo)注酒齡古越龍山黃酒的主成分二維得分圖。由圖8a可知，第1 主成分的分析值為71.88%，第2 主成分的分析值為14.19%，第1 主成分與第2 主成分之和為86.07%，表明PCA 第1、第2 主成分的結(jié)果可以代表GC-IMS 測(cè)定的各物質(zhì)強(qiáng)度值對(duì)5種不同標(biāo)注酒齡古越龍山黃酒的區(qū)分情況。由圖8a可知，不同標(biāo)注酒齡古越龍山黃酒能被很好的區(qū)分開來(lái)。

圖8b是3種不同品牌的5年陳釀黃酒的主成分二維得分圖，其第1 和第2 主成分貢獻(xiàn)率分別為43.83%和28.55%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)72.38%。古越龍山、塔牌和會(huì)稽山5年標(biāo)注酒齡黃酒在PCA圖中能較好的區(qū)分，并且每個(gè)種類的集中性較好，說(shuō)明PCA 分析具有較好的分類效果，能直觀的鑒別不同品牌樣品間的差異。

圖8 不同標(biāo)注酒齡古越龍山黃酒和不同品牌5年標(biāo)注酒齡黃酒的主成分分析圖Fig.8 PCA score plots of PC1 and PC2 of Guyuelongshan Chinese rice wine samples of various marking age and 5-year marking age Chinese rice wine samples of different company brands

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究建立了氣相離子遷移譜快速鑒別不同品牌及標(biāo)注酒齡黃酒的技術(shù)。通過離子遷移譜的揮發(fā)性有機(jī)物分析，發(fā)現(xiàn)苯甲醛、乙酸異戊酯和丁酮含量在不同品牌及標(biāo)注酒齡的黃酒中差異較大，可作為快速檢測(cè)黃酒的不同標(biāo)注酒齡及品牌指標(biāo)，并且利用PCA 分析能將不同品牌及標(biāo)注酒齡黃酒較好的區(qū)分開來(lái)。該方便快捷操作簡(jiǎn)單快速、靈敏度高，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的分析方法，為我國(guó)市售黃酒標(biāo)注酒齡及不同品牌的快速鑒定提供了一種新方法。