基于iTRAQ技術(shù)研究錳離子缺乏對植物乳桿菌的影響

程 新 董 英 李昆太

（1 江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)利用工程實驗室 南昌330045 2 江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院 南昌330045 3 江蘇大學食品與生物工程學院 江蘇鎮(zhèn)江212013

植物乳桿菌是一種常見于奶油、肉類及蔬菜發(fā)酵制品中的乳酸菌，能通過胃定植于腸道發(fā)揮有益作用[1]。由于其具有較好的產(chǎn)酸及益生功能，因此在食品發(fā)酵、工業(yè)乳酸發(fā)酵以及醫(yī)療保健等領(lǐng)域都有著廣泛的應用[2]。長期以來，通過優(yōu)化培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件等方式提高菌體發(fā)酵密度，降低生產(chǎn)成本的研究不斷出現(xiàn)[3-5]。

由于乳酸菌缺乏合成某些生長因子和代謝關(guān)鍵酶，因此在培養(yǎng)的過程中需要添加復合氮源和某些生長因子。其中，金屬離子是影響乳酸菌生長與代謝的重要因素[6]。課題組前期工作表明，錳離子的存在不僅影響乳酸菌的生長，而且對乳酸菌發(fā)酵活力至關(guān)重要[7]。當培養(yǎng)基中缺乏足夠濃度的錳離子時，培養(yǎng)出的乳酸菌密度下降，菌體在轉(zhuǎn)接后發(fā)酵能力顯著降低，而這一過程可能與培養(yǎng)基中錳離子缺乏，影響乳酸菌的胞內(nèi)代謝有關(guān)[8]，目前其機理尚不清楚。

蛋白質(zhì)組學分析（Proteomics analysis）已成為對乳酸菌的細胞應激反應或其能量代謝途徑研究的有力工具[9]。本研究在前期工作基礎上，以自行篩選的植物乳桿菌為研究對象，采用iTRAQ 技術(shù)研究錳離子缺乏對植物乳桿菌代謝的影響，為提高乳酸菌發(fā)酵劑生產(chǎn)水平提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）DY-2，課題組自行分離鑒定。

MRS 培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，植物蛋白胨10，牛肉浸膏8，無水乙酸鈉5，磷酸氫二鉀2，酵母粉4，檸檬酸鈉2，七水硫酸鎂0.58，四水硫酸錳0.25，吐溫1 mL。

菊芋浸汁培養(yǎng)基，配方見參考文獻[8]。

裂解液緩沖液的配制：8 mol/L 尿素、30 mmol/L HEPES、1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA、10 mmol/L DTT。

1.2 培養(yǎng)方法及樣品收集

保藏于-20 ℃的植物乳桿菌菌種用MRS 液體培養(yǎng)基活化8 h（活菌數(shù)大約1.8×109CFU/mL），按2%接種量接種于優(yōu)化后的菊芋浸汁發(fā)酵培養(yǎng)基（MnSO4·4H2O 添加量為0.5 g/L），以不添加錳離子的優(yōu)化菊芋浸汁培養(yǎng)基為對照（錳離子質(zhì)量濃度低于0.001 g/L），發(fā)酵溫度34 ℃，發(fā)酵時間20～24 h，在不同時間點（6，9 h）取樣放入-80 ℃保存。每個樣品設置2 個重復。

1.3 樣品制備

將冷凍的樣品取出，直接加入適量裂解液，加入蛋白酶抑制劑（PMSF 或Cocktail）使其終濃度為1 mmol/L，用移液器吹打至分散狀態(tài)。冰上超聲破碎，功率80 W，超聲0.8 s，關(guān)閉0.8 s，共3 min。加入5 倍體積的預冷丙酮振蕩混合，-20 ℃沉淀2 h或過夜。4 ℃，12 000×g 離心10 min，收集沉淀。加入適量體積的預冷丙酮振蕩混合，4 ℃，12 000×g離心15 min，收集沉淀，重復該步驟1 次。常溫下干燥后，溶解于樣品裂解液中，充分溶解蛋白。將溶液在室溫下12 000×g 離心15 min，取上清，并再次離心取上清，充分去除不容性雜質(zhì)。上清液即為組織的總蛋白溶液，分裝后儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。蛋白濃度測定參考Bradford等[10]的方法。

1.4 蛋白還原烷基化及酶解

參考FASP 方法[11]酶解蛋白。蛋白定量后每個樣品各取100 μg，采用5 倍體積預冷丙酮進行沉淀，-20 ℃放置1 h，充分沉淀蛋白。4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取沉淀真空冷凍干燥。采用50 μL iTRAQ 試劑盒中的溶解緩沖液充分溶解蛋白沉淀，加入4 μL 還原劑，60 ℃反應1 h。加入2 μL半胱氨酸阻斷試劑室溫反應10 min，將還原烷基化后的蛋白溶液加入10 K 的超濾管中，12 000 r/min 離心20 min，棄掉收集管底部溶液。加入100 μL 溶解緩沖液，12 000 r/min 離心20 min，棄掉收集管底部溶液，重復3 次。更換新收集管，在超濾管中加入50 μL 質(zhì)量濃度為50 ng/μL 的測序級胰蛋白酶溶液，37 ℃反應12 h。12 000 r/min 離心20 min，收集酶解后肽段，在超濾管中再加入50 μL溶解緩沖液，12 000 r/min 離心20 min，收集管底溶液并與前次溶液合并。

1.5 蛋白標記及質(zhì)譜預試驗

從冰箱中取出iTRAQ 試劑，平衡到室溫；將iTRAQ 試劑離心至管底；用150 μL 異丙醇溶解i-TRAQ 試劑。取50 μL 樣品（100 μg 酶解產(chǎn)物）轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入iTRAQ 試劑后室溫反應2 h；加入100 μL 水終止反應；混合所有標記樣品，渦旋振蕩，離心至管底；真空冷凍干燥樣品，留作iTRAQ 分離鑒定。

1.6 反向色譜-TripleTOF 分析

將凍干的多肽樣品重新溶解于Nano-RPLC Buffer A 中。在線Nano-RPLC 液相色譜在Eksigent nanoLC-UltraTM2D 系統(tǒng)（AB SCIEX）進行，溶解后的樣品以2 μL/min 的流速上樣到C18 預柱上（100 μm×3 cm，C18，3 μm，150 ?），然后保持流速沖洗脫鹽10 min。分析柱為C18 反相色譜柱（75 μm×15 cm C18，3 μm 120 ?，ChromXP Eksigent），試驗所用梯度為70 min 內(nèi)流動相B 由5%升高至35%。質(zhì)譜采用TripleTOF5600 系統(tǒng)（AB SCIEX）結(jié)合納升噴霧III 離子源（AB SCIEX，USA），噴霧電壓為2.5 kV，氣簾氣壓為30 PSI，霧化氣壓為5 PSI，加熱器溫度為150 ℃，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式下（Information Dependent Analysis，IDA），一級TOF-MS單張圖譜掃描時間為250 ms，每次IDA 循環(huán)下最多采集35 個電荷為2+到5+且單秒計數(shù)大于150的二級圖譜，每次循環(huán)時間固定為2.5 s，碰撞室能量設定適用于所有前體離子碰撞誘導解離（CID），動態(tài)排除設置為18 s。

1.7 蛋白定性和定量

數(shù)據(jù)處理采用含Paragon algorithm 算法的Protein Pilot Software v.5.0（AB SCIEX，USA）軟件進行，試驗使用數(shù)據(jù)庫為植物乳桿菌數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫來源于NCBI。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜檢測與差異表達蛋白鑒定結(jié)果

經(jīng)過iTRAQ 分析后，以5% FDR 來計算，共匹配到本地譜圖（Spectra）41 801 個，鑒定到特有肽段（Unique Spectra）序列8 188 個，鑒定到蛋白質(zhì)（Protein）966 個，這些蛋白的功能涉及到細胞代謝、能量代謝、應激反應、信號轉(zhuǎn)導及未知蛋白等各個方面。當?shù)鞍椎呢S度比即差異倍數(shù)達到1.3倍以上（或0.7 倍以下）且經(jīng)統(tǒng)計檢驗的P<0.05時，定義該蛋白為兩樣品間的差異蛋白。本次試驗差異蛋白的基本情況如表1所示。

2.2 發(fā)酵6 h 差異蛋白的GO 及KEGG 分析

乳酸菌在發(fā)酵6 h 后進入對數(shù)生長期，此時菌體代謝非常旺盛。經(jīng)過蛋白質(zhì)組學分析，共檢測出56 個差異蛋白，其中下調(diào)蛋白25 個，上調(diào)蛋白31 個。

在25 個下調(diào)差異蛋白中，與核糖體結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白（ribosomal protein）有7 個，其中30S 核糖體蛋白S20 下降至對照組的0.275 倍，50S 核糖體蛋白L27 下降至對照組的0.562 倍，30S 核糖體蛋白S11 下降至對照組的0.673 倍。由于核糖體蛋白主要參與蛋白質(zhì)的合成過程，說明錳離子缺乏的情況下，乳酸菌蛋白合成途徑會受到一定抑制。與代謝相關(guān)的酶類有5 個[其中與精氨酸合成密切相關(guān)的精氨酰琥珀酸裂解酶（argininosuccinate lyase）下調(diào)幅度超過1 倍]，主要參與蛋白質(zhì)或氨基酸代謝；與復制、轉(zhuǎn)錄、復制過程相關(guān)的蛋白也有5 個；而與信號傳導相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）和雙組分組氨酸蛋白激酶（two component system histidine protein kinase）在錳離子缺乏的情況下表達均出現(xiàn)了下降趨勢。

在上調(diào)的31 個差異蛋白中，與復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程相關(guān)的蛋白共有8 個，其中3 個蛋白（酶）與DNA 的修復過程有關(guān)[A/G 特異性腺嘌呤糖基化酶（A/G-specific adenine glycosylase），ATP 依賴性核酸酶亞基B（ATP-dependent nuclease subunit B）以及調(diào)控蛋白 recX（regulatory protein recX），分別上調(diào)1.401，1.456 和1.367 倍]，同時還有2 個與應激反應相關(guān)的蛋白[蛋白酶HtpX 同源物（Protease HtpX homolog）和廣譜應激蛋白UspA 家族（universal stress protein UspA family）]表達量也顯著上升（分別為1.52 和1.55 倍），說明在錳離子缺乏的情況下，乳酸菌的代謝出現(xiàn)了異?，F(xiàn)象。

為了更好地了解錳離子缺乏對乳酸菌代謝的影響，將56 個差異表達蛋白進行GO（Gene Ontology）富集分析和KEGG 代謝通路分析，結(jié)果如下。

圖1 發(fā)酵6 h 差異蛋白GO 功能注釋結(jié)果Fig.1 GO function annotation results of differentially expressed proteins after fermentation for 6 h

以顯著性檢驗的P 值為指標對富集結(jié)果進行排序，其中差異蛋白參與的生物學過程中最為顯著的過程分別為翻譯（translation，8 個基因）、錯配修復（mismatch repair，3 個基因）、細胞移動（cell motility，2 個基因）、溫度應激響應（response to stimulus，2 個基因）和精氨酸合成代謝（arginine biosynthetic process，2 個基因）。而從分子功能角度，排名前五的分別是核糖體結(jié)構(gòu)（structural constituent of ribosome，8 個基因）、氨甲酰基-磷酸合成酶（carbamoyl-phosphate synthase，3 個基因）、核糖體RNA 結(jié)合（rRNA binding，6 個基因）、小核糖體亞基rRNA 結(jié)合（small ribosomal subunit rRNA binding，3 個基因）和丁二胺跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（putrescine transmembrane transporter activity，2個基因）。

Pathway 的綜合分析可以使我們對生物學網(wǎng)絡和生物學過程進行整體分析，對于彌補蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組學檢測分析技術(shù)的局限性有很大幫助[12-13]，使用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）Pathway 數(shù)據(jù)庫對發(fā)酵6 h 的乳酸菌胞內(nèi)差異蛋白進行通路富集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在α=0.05 的顯著水平下，只有核糖體（ribosome）的代謝通路產(chǎn)生了顯著性變化，而丙氨酸-天冬氨酸鹽-谷氨酸鹽代謝通路（Alanine，aspartate and glutamate metabolism）在α=0.1 的水平下差異顯著（P=0.070）。

表2 發(fā)酵6 h 后差異表達蛋白的Pathway 分析Table 2 Pathway analysis based on differentially expressed proteins after fermentation for 6 h

綜合上述分析結(jié)果可以看出，錳離子缺乏會對蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生顯著的抑制作用，影響乳酸菌的蛋白質(zhì)代謝。同時，在錳離子缺乏的情況下，乳酸菌處于不正常的生長狀態(tài)，細胞內(nèi)與錯配修復和應激反應相關(guān)的蛋白質(zhì)含量顯著上升。

2.3 發(fā)酵9 h 差異蛋白的GO 及KEGG 分析

發(fā)酵9 h 后，植物乳桿菌發(fā)酵進入對數(shù)生長末期，在此階段共檢測出78 個差異蛋白，其中上調(diào)蛋白40 個，下調(diào)蛋白38 個。

Daly等[14]認為耐輻射球菌細胞內(nèi)高濃度的錳離子能保護其細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)不受氧化，從而使其存活率提高。在培養(yǎng)基中缺乏錳離子的情況下，乳酸菌胞內(nèi)錳離子轉(zhuǎn)運蛋白（manganese transport protein）的表達量提高了4 倍左右，是胞內(nèi)蛋白中表達量提高最為顯著的蛋白之一，這說明在缺乏錳離子的情況下，乳酸菌必須過量地表達該蛋白以加快錳離子的運輸。參與復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程的蛋白共有5 個出現(xiàn)了上調(diào)，其中3 個蛋白（酶）與DNA 的修復過程有關(guān)，同時還有2 個與應激反應相關(guān)的蛋白表達量也顯著上升，這一結(jié)果與發(fā)酵6 h 的規(guī)律相一致，說明錳離子缺乏會導致乳酸菌的代謝處于不正常狀態(tài)。

與核糖體結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白有3種下調(diào)，而與轉(zhuǎn)錄、復制、翻譯相關(guān)的酶和蛋白有12種下調(diào)，其中大多屬于轉(zhuǎn)錄或翻譯的調(diào)控因子。

為了更好地了解錳離子缺乏對乳酸菌代謝的影響，將78 個差異表達蛋白進行GO 富集分析和KEGG 代謝通路分析，結(jié)果如下。

從GO 分析的結(jié)果來看，差異蛋白參與的生物學過程中最為顯著的過程分別為脂肪酸合成（fatty acid biosynthetic process，6 個基因）、金屬離子運輸（metal ion transport，3 個基因）、錳離子運輸（manganese ion transport，2 個基因）、鎘離子運輸（cadmium ion transport，2 個基因）、溫度應激響應（response to temperature stimulus，2 個基因）和脂肪酸代謝（fatty acid metabolic process，3 個基因）。從分子功能角度，排名前五的分別是乙醇脫氫酶（NAD）活性[alcohol dehydrogenase（NAD）activity，8 個基因]、二氫葉酸合酶活性（dihydrofolate synthase activity，2 個基因）、四氫葉酸聚谷氨酸合酶活性（tetrahydrofolylpolyglutamate synthase activity，2 個基因）、脂肪酸合成過程中ACP 磷酸泛素附著位點結(jié)合（ACP phosphopantetheine attachment site binding involved in fatty acid biosynthetic process，2 個基因）和3-辛烯基-4-羥苯酸鹽羧酸分解酶活性（3-octaprenyl-4-hydroxybenzoate carboxy-lyase activity，2 個基因）。

使用KEGG Pathway 數(shù)據(jù)庫對發(fā)酵9 h 的乳酸菌胞內(nèi)差異蛋白進行通路富集分析，結(jié)果如表3所示。從富集結(jié)果可以看出，發(fā)酵9 h 后，多條與胞內(nèi)代謝相關(guān)的通路產(chǎn)生了顯著變化，除了奈和氯烷烴降解通路外，丙酮酸代謝、酪氨酸代謝、脂肪酸降解、糖異生和糖酵解途徑等通路均產(chǎn)生了明顯的變化。

與發(fā)酵6 h 的樣品相比，發(fā)酵進行到平臺期時，差異蛋白主要參與胞內(nèi)的碳、氮及脂肪酸等代謝通路，說明其影響主要集中在胞內(nèi)代謝方面。

圖2 發(fā)酵9 h 差異蛋白GO 功能注釋結(jié)果Fig.2 GO function annotation results of differentially expressed proteins after fermentation for 9 h

2.4 共有差異蛋白分析

研究在整個發(fā)酵過程中持續(xù)性表現(xiàn)出差異的蛋白更加有助于考察錳離子對乳酸菌代謝的影響。統(tǒng)計發(fā)酵6 h 和9 h 的共有差異蛋白，結(jié)果如表4所示。2 個發(fā)酵時間點共有16種蛋白均表現(xiàn)出顯著性差異，其中有6種蛋白在缺乏錳離子的情況下持續(xù)下調(diào)，7種蛋白在缺乏錳離子的情況下持續(xù)上調(diào)，A/G 特異性腺嘌呤糖基化酶（A/Gspecific adenine glycosylase）和rRNA 甲基化酶（rRNA methylase）在發(fā)酵6 h 因錳離子的缺乏而下調(diào)，但發(fā)酵9 h 后又產(chǎn)生上調(diào)趨勢；未知蛋白（hypothetical protein）lp_0158 在發(fā)酵6 h 隨錳離子缺乏而下調(diào)，但在發(fā)酵9 h 后又產(chǎn)生上調(diào)趨勢。

UspA 家族蛋白主要參與生物體的應激反應，一般在微生物生長受到抑制或細胞受損的情況下會大量表達[15-16]，從表4 中可以看出，該蛋白在發(fā)酵6 h 和發(fā)酵9 h 都屬于上調(diào)幅度最大的蛋白之一，特別是在發(fā)酵9 h 的表達量增加了近5 倍，說明錳離子的缺乏造成細胞狀態(tài)的嚴重不正常；同時胞內(nèi)參與DNA 修復過程的ATP 依賴性核酸酶表達量也持續(xù)上升，再次說明錳離子缺乏對乳酸菌的DNA 復制乃至整個菌體都可能造成嚴重的損傷。

表3 發(fā)酵9 h 后差異表達蛋白的Pathway 分析Table 3 Pathway analysis based on differentially expressed proteins after fermentation for 9 h

A/G 特異性腺嘌呤糖基化酶主要起到DNA的N-端糖基化功能，參與DNA 的修復過程[17]，這個酶在發(fā)酵初期隨著錳離子的缺乏而上調(diào)，但在發(fā)酵后期又出現(xiàn)下調(diào)趨勢，但此時ATP 依賴性核酸酶等同樣參與修復的蛋白表達量上升，說明DNA 的修復途徑可能在發(fā)酵后期發(fā)生改變。而rRNA 甲基化酶主要參與RNA 的甲基化過程，是一種參與基因表達微調(diào)控的酶[18-19]，與多種脅迫環(huán)境的產(chǎn)生密切相關(guān)[20]。本研究結(jié)果表明植物乳桿菌胞內(nèi)rRNA 甲基化酶在發(fā)酵6 h 隨著錳離子的缺乏而表達上調(diào)，而在發(fā)酵9 h 時又產(chǎn)生下調(diào)趨勢。

表4 發(fā)酵6 h 和9 h 后共有差異蛋白Table 4 Identification of the common differential proteins after fermentation for 6 h and 9 h

在發(fā)酵過程中因錳離子缺乏而持續(xù)上調(diào)的已知功能蛋白還包括NADH 過氧化物酶等3種蛋白，其中NADH 過氧化物酶主要參與生物體內(nèi)氧化-還原平衡，UPF0316 蛋白lp_1140是生物體細胞膜的結(jié)構(gòu)蛋白之一，1 型谷氨酰胺酰胺轉(zhuǎn)移酶樣結(jié)構(gòu)域主要參與谷氨酰胺的代謝，是微生物體內(nèi)重要的氨基酸代謝蛋白之一。

在發(fā)酵過程中隨著錳離子缺乏而持續(xù)下調(diào)的蛋白有6種，其中功能確定的共有3種，精氨琥珀酸裂合酶、甲基轉(zhuǎn)移酶和翻譯起始因子IF-1。其中精氨琥珀酸裂合酶主要參與精氨酸的合成代謝，甲基轉(zhuǎn)移酶主要參與核酸的甲基轉(zhuǎn)移，翻譯起始因子IF-1 則是翻譯過程的起始因子。

為了更好地考察這些差異蛋白在微生物體內(nèi)參與的代謝通路，對共同差異蛋白進行KEGG Pathway 分析，顯著水平在α=0.1 的代謝通路如表5所示。

表5 共有差異表達蛋白的Pathway 分析Table 5 Pathway analysis based on differentially expressed proteins

從表5 中可以看出，在α=0.1 的水平上，錳離子的添加對丙酮酸代謝通路的影響均極顯著。與此同時，錳離子添加對丙酸代謝、丁酸甲酯代謝和丙氨酸-天冬氨酸鹽-谷氨酸鹽代謝通路等代謝途徑也有顯著影響。這些途徑與丙酮酸代謝通路一樣，都是生物體內(nèi)重要的基礎代謝途徑，而且這些代謝通路之間都存在密切關(guān)聯(lián)，說明錳離子對乳酸菌胞內(nèi)代謝通路起到重要的調(diào)節(jié)作用，而且這一影響的范圍不僅局限于胞內(nèi)葡萄糖代謝途徑[8]，還會對氨基酸、有機酸等物質(zhì)的合成與代謝產(chǎn)生重要影響。

從代謝通路分析中還可以看出，堿基切除修復和同源重組2 個與DNA 復制相關(guān)的代謝通路均發(fā)生了較為顯著的變化，錳離子的存在有助于提高菌體對氧化等外界損傷的耐受性，提高菌體的抗逆性，這一點與以往的文獻報道是一致的。

3 討論

錳是生命體必需元素，是具有多種重要生理功能的酶的組成部分，如錳超氧化物歧化酶、錳過氧化氫酶、精氨酸酶、丙酮酸羧化酶等[21]。Martin等[22]的研究表明，適當?shù)腻i穩(wěn)態(tài)對肺炎鏈球菌的細胞生長至關(guān)重要；Kubicek等[23]的研究表明，在錳的存在下，黑曲霉細胞生長會增加，但糖消耗減少，酸生成急劇減少，而在錳離子缺乏的情況下，黑曲霉胞內(nèi)除了檸檬酸合成酶以外，其它三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶以及細胞的合成代謝均會產(chǎn)生抑制，而這種抑制與糖消耗的速率顯著相關(guān)。但過量的錳離子對細胞也有相當大的毒害作用，細胞內(nèi)的谷氨酸（Glu）會由于錳離子過量累積而明顯增高，細胞外谷氨酰胺（Gln）明顯降低，影響“谷氨酸－谷氨酰胺循環(huán)”，導致對生物體的傷害[24]。課題組前期研究結(jié)果表明，在錳離子缺乏的情況下，乳酸菌發(fā)酵活力會受到顯著的影響，同時與三羧酸循環(huán)相關(guān)的酶活均會受到一定的抑制[8]。而本研究結(jié)果進一步表明，在發(fā)酵進行至對數(shù)生長期時，錳離子缺乏會造成核糖體結(jié)構(gòu)蛋白合成通路顯著受到抑制，而這可能與包括RNA 聚合酶在內(nèi)的許多酶活性需要錳離子參與有關(guān)[25]。而當發(fā)酵進行至對數(shù)生長末期時，錳離子缺乏主要影響乳酸菌的碳、氮等代謝通路。丙酮酸代謝、脂肪酸降解等多條代謝通路會由于錳離子的缺乏而受到顯著影響。

錳離子的存在對于生物體的抗氧化系統(tǒng)及應激反應系統(tǒng)至關(guān)重要[26]。當微生物處在脅迫環(huán)境（如酸脅迫、膽鹽脅迫等）下時，應激蛋白質(zhì)通常被誘導表達，并在基因和蛋白質(zhì)的表達和修復過程中起著至關(guān)重要的作用[27]。Horsburgh等[28]的研究表明，適當濃度錳離子的存在改善了各種微生物耐受氧化應激的能力，在外界脅迫的條件下，細胞會大量運輸錳離子進入細胞內(nèi)，從而激活其抗氧化系統(tǒng)的活性。而這種效應主要是由于其金屬化單核酶的能力相關(guān)，而非通過清除過氧化物來保護過氧化物應激細胞[29]。從本研究結(jié)果可以看出，乳酸菌胞內(nèi)與DNA 修復和應激反應相關(guān)的蛋白表達量隨著錳離子的缺乏而顯著升高，說明此時菌體處于不正常生長狀態(tài)。

綜上所述，本研究利用iTRAQ 技術(shù)比較分析了錳離子缺乏對植物乳桿菌蛋白表達的影響，試驗結(jié)果表明，錳離子缺乏主要影響乳酸菌胞內(nèi)蛋白的合成代謝，同時會使乳酸菌處于不正常的生理狀態(tài)，DNA 修復系統(tǒng)和與應激反應相關(guān)的蛋白表達量會顯著上升。而這一狀態(tài)與乳酸菌的生理代謝之間的細致關(guān)聯(lián)則有待進一步研究。