細(xì)菌素bifidocin A對(duì)凝固型發(fā)酵乳品質(zhì)及貯藏性能的影響

邱 爽 宋 錚 張璟琳 王落琳，3 劉國榮* 孫寶國

（1 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心北京工商大學(xué) 北京100048 2 天津大學(xué)化工學(xué)院 天津300350 3 首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京100048）

酸奶是以生牛（羊）乳或乳粉為原料，經(jīng)過殺菌并接種嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌（德氏乳桿菌保加利亞亞種）發(fā)酵等工藝而制成的一種乳制品。由于其具有營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特且易于人體消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，所以深受大眾喜愛。然而，酸奶在貯藏過程中會(huì)發(fā)生后酸化現(xiàn)象，即酸奶在結(jié)束正常發(fā)酵后，在貯存、運(yùn)輸、銷售、飲用前等過程中，酸奶的菌體仍在不斷繁殖，酸度持續(xù)上升，出現(xiàn)消費(fèi)者難以接受的過酸味和感官品質(zhì)的下降，進(jìn)而影響酸奶的貯藏性能及跨地域銷售[1-2]。

國內(nèi)外研究學(xué)者廣泛開展了酸奶弱酸化發(fā)酵菌株的篩選，這種優(yōu)質(zhì)菌株的篩選十分困難，現(xiàn)存的優(yōu)質(zhì)菌株大多掌握在國外企業(yè)機(jī)構(gòu)手中，引入這些菌株會(huì)大大提高中國乳品企業(yè)的成本[3-5]。目前食品工業(yè)上普遍使用的防止酸奶后酸化的方法有發(fā)酵后二次加熱處理[6]，發(fā)酵后快速冷卻[2，6]，改變保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的比例[7]，添加乳酸鏈球菌素（nisin）[8]，添加葡萄糖氧化酶等[9-10]。發(fā)酵后快速冷卻目的是使菌體的活力下降。改變保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的比例是通過增加發(fā)酵劑中球菌對(duì)桿菌的比例，使酸奶后發(fā)酵減弱。添加葡萄糖氧化酶是通過黑曲霉、點(diǎn)青霉等發(fā)酵制得的一種需氧脫氫酶，作為天然食品防腐劑除去食品中的氧，從而有效防止食品腐敗。乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌代謝過程中合成并分泌到環(huán)境中的一類對(duì)同種或親緣較近的種有抑制作用的殺菌蛋白或多肽。其中，乳酸鏈球菌產(chǎn)生的乳鏈菌素已成功應(yīng)用于食品工業(yè)控制酸奶后酸化。

動(dòng)物雙歧桿菌BB04可代謝合成新型廣譜高效細(xì)菌素bifidocin A，是國內(nèi)外首次報(bào)道的產(chǎn)細(xì)菌素的動(dòng)物雙歧桿菌[11]。課題組前期已建立bifidocin A 的提取純化方法，分析了該細(xì)菌素的分子結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性和抑菌機(jī)理，確定其有作為天然食品生物防腐劑的巨大應(yīng)用潛力[12-14]。為探討細(xì)菌素bifidocin A 在凝固型酸奶生產(chǎn)、加工及貯藏過程中的應(yīng)用可行性，本研究以添加乳酸鏈球菌素為對(duì)照組，設(shè)置細(xì)菌素bifidocin A 的不同添加量（56，28，14 mg/mL）處理組，通過測(cè)定凝固型酸奶28 d 貯藏期內(nèi)pH 值、可滴定酸度、持水力、活菌數(shù)、流變特性、質(zhì)構(gòu)性、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等指標(biāo)變化，分析比較細(xì)菌素bifidocin A 對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)及貯藏性能的影響，旨在為雙歧桿菌細(xì)菌素的應(yīng)用推廣提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商業(yè)凝固型酸奶發(fā)酵劑YC-350，丹麥科漢森股份有限公司；乳酸鏈球菌素，美國Sigma 公司（106IU/g）；MRS、MC 培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌素bifidocin A 純品（比活力5535 AU/mg，純度95.3%），本實(shí)驗(yàn)室自主分離提取純化[12]；巴氏殺菌奶、白砂糖，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

MCR 102 流變儀，安東帕公司；TMS-pilot 質(zhì)構(gòu)儀，美國FTC 公司；905 滴定儀，Titrando 公司；H185 離心機(jī)，天林恒泰科技有限公司；pH400 pH計(jì)，安萊立思儀器科技有限公司；TSQ 8000 Evo氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 酸奶的制備方法

1.3.1 酸奶的制備

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組 試驗(yàn)共設(shè)計(jì)5 組處理，其中未添加任何細(xì)菌素且僅含有商業(yè)凝固型酸奶發(fā)酵劑YC-350 組為空白對(duì)照組；在混合發(fā)酵劑基礎(chǔ)上添加終質(zhì)量濃度50 mg/mL 乳酸鏈球菌素組為陽性對(duì)照組；在混合發(fā)酵劑基礎(chǔ)上添加雙歧桿菌細(xì)菌素bifidocin A 組為處理組。將處理組按添加量不同分為3 組：高添加量組，細(xì)菌素bifidocin A 終質(zhì)量濃度為56 mg/mL；中添加量組，細(xì)菌素bifidocin A 終質(zhì)量濃度為28 mg/mL；低添加量組，細(xì)菌素bifidocin A 終質(zhì)量濃度為14 mg/mL。將制備的凝固型酸奶置于4 ℃貯藏，在貯藏第0，1，7，14，21，28 天分別檢測(cè)樣品的各項(xiàng)指標(biāo)，主要包括：pH、可滴定酸度、持水力、活菌數(shù)、流變特性、質(zhì)構(gòu)性及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。

1.4 凝固型酸奶指標(biāo)測(cè)定方法

1.4.1 凝固型酸奶pH 值的測(cè)定 采用數(shù)顯式pH計(jì)，在20 ℃室溫下分別測(cè)定5 組樣品的pH 值。

1.4.2 凝固型酸奶可滴定酸度的測(cè)定 采用酸度滴定儀測(cè)定酸度值，取8 g 樣品加入適量去離子水作為待測(cè)樣本，滴定液為1 mol/L 的NaOH 溶液，直接用滴定儀測(cè)滴定酸度。

1.4.3 凝固型酸奶持水力的測(cè)定 取適量后熟后的發(fā)酵乳，稱重放入離心管中，以2 340 r/min 離心10 min，除去乳清后再次稱重，按下式計(jì)算其持水力。

持水力（%）=離心后沉淀物質(zhì)量（g）/樣品質(zhì)量（g）×100[15]

1.4.4 凝固型酸奶活菌數(shù)的測(cè)定 采用選擇性培養(yǎng)基，通過菌落平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。分別將5個(gè)處理組酸奶樣品用生理鹽水稀釋到適當(dāng)?shù)奶荻群蟮谷胗?jì)數(shù)用無菌培養(yǎng)皿，用MRS 培養(yǎng)基測(cè)定保加利亞乳桿菌活菌數(shù)、用MC 培養(yǎng)基測(cè)定嗜熱鏈球菌活菌數(shù)，37 ℃培養(yǎng)36 h，計(jì)數(shù)結(jié)果取對(duì)數(shù)。

1.4.5 凝固型酸奶流變特性的測(cè)定 將發(fā)酵乳按順時(shí)針和逆時(shí)針分別攪拌10 圈后，取5 滴于流變儀檢測(cè)平臺(tái)上，選取直徑40 mm 探頭，控制溫度為25 ℃。分析模式為：頻率掃描，頻率從0.01～10 Hz，用Herschel-Bulkley 模型進(jìn)行擬合分析。

1.4.6 凝固型酸奶質(zhì)構(gòu)的測(cè)定 用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行TPA 分析。采用直徑為50 mm 的柱形探頭，探頭下降速度90 cm/s，返回速度90 m/s，壓縮距離10 mm，返回距離10 mm，觸及力0.1 g。通過分析力獲得硬度、內(nèi)聚性、彈性、咀嚼性和黏附性、膠黏性6個(gè)TPA 參數(shù)。

1.4.7 凝固型酸奶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定 取3 g 發(fā)酵乳樣品置于15 mL 的頂空瓶中，加入3 mL飽和NaCl 溶液，加入10 μL 含有0.001%壬酸甲酯的甲醇溶液。在40 ℃條件下平衡10 min 后，用聚二甲硅氧烷（PDMS）纖維頭萃取，40 ℃吸附40 min，GC 解析3 min，用于GC-MS 分析。

GC 條件為分流方式不分流。程序升溫：40 ℃保持4 min，以5 ℃/min 的速度升溫至100 ℃，然后以10 ℃/min 的速度升溫到220 ℃保持5 min。載氣為氦氣，體積流量為0.8 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。

MS 條件為：EI 電離源，電子能量為70 eV，燈絲電流為0.20 mA，檢測(cè)器350 V，掃描范圍為30～450 amu，離子源溫度為200 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝固型酸奶貯藏過程中pH 值的變化

pH 值是評(píng)價(jià)發(fā)酵乳的重要指標(biāo)之一，也是發(fā)酵乳制品口感和品質(zhì)的重要影響因素。試驗(yàn)中，不同處理組酸奶在貯藏過程中pH 值變化情況如圖1所示，可以看出，發(fā)酵過程中，乳酸菌利用乳品中的碳源產(chǎn)生乳酸，使pH 值下降。其中空白對(duì)照組在貯藏中pH 下降趨勢(shì)明顯，一般酸奶適口的pH 值為4.2～4.7，空白對(duì)照組pH 值達(dá)4.2 以下，后酸化較為嚴(yán)重。添加了細(xì)菌素的4 組處理組在貯藏中pH 值下降較為平緩，尤其以添加56 mg/mL bifidocin A 組下降最為平緩，最終pH 值均大于4.2。其中，添加28 mg/mL bifidocin A 組與添加50 mg/mL 乳酸鏈球菌素組在貯藏過程中pH 值下降趨勢(shì)最為接近。

2.2 凝固型酸奶貯藏過程中可滴定酸度的變化

圖2所示為不同處理組凝固型酸奶在貯藏過程中可滴定酸度變化情況。由圖可知，凝固型酸奶在貯藏過程中，可滴定酸度均呈升高趨勢(shì)，空白對(duì)照組上升最為迅速，根據(jù)GB 5413.34-2010《乳和乳制品酸度的測(cè)定》中規(guī)定發(fā)酵乳的酸度應(yīng)>70°T[16-17]，最佳食用酸度為80～120°T[18-19]，空白對(duì)照組在第28 天時(shí)，酸度己超過120°T，后酸化現(xiàn)象十分嚴(yán)重。這是由于酸奶制品中殘留的乳糖被活菌繼續(xù)分解產(chǎn)酸，導(dǎo)致酸度持續(xù)上升。添加56 mg/mL bifidocin A 組可滴定酸度上升趨勢(shì)最為平緩，添加28 mg/mL bifidocin A 組與添加50 mg/mL 乳酸鏈球菌素組可滴定酸度上升趨勢(shì)最為接近，且在發(fā)酵28 d 后酸度仍符合最佳食用酸度標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 凝固型酸奶貯藏過程中pH 值的變化Fig.1 Changes of set yogurt on pH value during storage

圖2 凝固型酸奶貯藏過程中可滴定酸度的變化Fig.2 Changes of set yogurt on titratable acidity during storage

2.3 凝固型酸奶貯藏過程中活菌數(shù)的變化

不同處理組酸奶在貯藏過程中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)變化情況分別如圖3 和圖4所示。由圖3可知，發(fā)酵結(jié)束后，56 mg/mL bifidocin A 處理組保加利亞乳桿菌活菌數(shù)明顯低于其它4 組處理，這可能是由于添加高質(zhì)量濃度的細(xì)菌素嚴(yán)重影響了酸奶生產(chǎn)中保加利亞乳桿菌的增長所致；除56 mg/mL bifidocin A 處理組外，其它4 個(gè)處理組均表現(xiàn)較為類似的活菌數(shù)變化趨勢(shì)，活菌數(shù)在發(fā)酵期間上升迅速，發(fā)酵完成后且貯藏7 d 內(nèi)基本保持不變，之后逐漸減?。▓D3），這可能是貯藏前期酸奶中乳糖等營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，乳酸菌活菌數(shù)量穩(wěn)定或有所增長，隨著貯藏時(shí)間的延長，乳酸菌因缺乏營養(yǎng)物質(zhì)而逐漸衰亡，從而導(dǎo)致活菌數(shù)降低；通過比較不同處理組間活菌數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵完成后空白對(duì)照組活菌數(shù)高于其它添加細(xì)菌素處理組，且在貯藏前期活菌數(shù)緩慢增長，說明細(xì)菌素的添加可不同程度抑制酸奶貯藏中乳酸菌的增長。值得關(guān)注的是：空白對(duì)照組在貯藏7 d 后出現(xiàn)了大幅下降，28 d 時(shí)活菌數(shù)達(dá)到2×108CFU/mL，而添加細(xì)菌素處理組活菌數(shù)下降緩慢，其中，添加28 mg/mL bifidocin A 組、添加14 mg/mL bifidocin A 組與添加50 mg/mL 乳酸鏈球菌素組在28 d 時(shí)活菌數(shù)都在5×108CFU/mL左右?？傮w來看，在貯藏前期空白對(duì)照組雖然活菌數(shù)較高，而在貯藏后期添加28 mg/mL bifidocin A組、添加14 mg/mL bifidocin A 組與添加50 mg/mL乳酸鏈球菌素組活菌數(shù)明顯高于空白對(duì)照組。由圖4可知，發(fā)酵結(jié)束后，嗜熱鏈球菌活菌數(shù)略低于保加利亞乳桿菌，而在貯藏過程中變化的整體趨勢(shì)與保加利亞乳桿菌基本一致。

2.4 凝固型酸奶貯藏過程中持水力的變化

圖5所示為不同處理組凝固型酸奶在貯藏過程中持水力變化情況，由圖可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，不同的處理組持水力指標(biāo)均有下降，其中以空白對(duì)照組下降最為明顯，在貯藏第28 天時(shí)持水力小于68%，嚴(yán)重影響了凝固型酸奶的口感，添加28 mg/mL bifidocin A 組的持水力變化最為緩慢，貯藏前后期持水力變化不大，添加28 mg/mL bifidocin A 組與50 mg/mL 乳酸鏈球菌素組持水力變化趨勢(shì)最為接近，與添加14 mg/mL bifidocin A 組較為接近。

圖3 凝固型酸奶貯藏過程中保加利亞乳桿菌活菌數(shù)的變化Fig.3 Changes of set yogurt on viable counts of Lactobacillus bulgaria during storage

圖4 凝固型酸奶貯藏過程中嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的變化Fig.4 Changes of set yogurt on viable counts of Streptococcus thermophilus during storage

圖5 凝固型酸奶貯藏過程中持水力的變化Fig.5 Changes of set yogurt on water holding capacity during storage

2.5 凝固型酸奶貯藏過程中流變參數(shù)的變化

試驗(yàn)中采用Hershel-Bulkley 模型分析了不同處理組酸乳的流變參數(shù)變化情況，結(jié)果見表1，可以看出，4種樣品的相關(guān)系數(shù)均高于0.995，表明模型選擇合理。

Herschel-Bulkley 模型公式為：

屈服應(yīng)力τ0= τ-κr′n[20]

式中，τ——剪切應(yīng)力，Pa；κ——稠度系數(shù)，Pa·sn；r′——剪切速率，s-1；n——流動(dòng)特性指數(shù)。

流體的屈服應(yīng)力是指對(duì)非牛頓流體施加的剪應(yīng)力較小時(shí)流體只發(fā)生變形，不產(chǎn)生流動(dòng)，當(dāng)剪應(yīng)力增大到臨界值時(shí)流體才開始流動(dòng)，此時(shí)的臨界值剪應(yīng)力稱為該流體的屈服應(yīng)力，用τ0表示。流動(dòng)行為指數(shù)n 通過對(duì)比牛頓流體（n=1）的偏差程度，可以顯示樣品的流變學(xué)性質(zhì)：當(dāng)n＜1 時(shí)，樣品為假塑性流體；當(dāng)n>1 時(shí)，樣品為脹塑性流體，發(fā)酵酸乳為非牛頓流體一假塑性流體[21]，n 值均小于1。表觀黏度η300是指當(dāng)剪切速率為300 s-1時(shí)樣品的表觀黏度。

貯藏過程中各組酸奶的屈服應(yīng)力有先增大后減小的趨勢(shì)，由于屈服應(yīng)力值與硬度相關(guān)[22]，說明在貯藏過程中凝固型酸奶的硬度先增大后減??；從稠度系數(shù)和表觀黏度來看，各組稠度系數(shù)變化不明顯（P＞0.05），說明不同處理對(duì)凝固型酸奶剪切稀化的特性影響不大。貯藏過程中各組酸奶的表觀黏度均有下降趨勢(shì)，但各組之間表觀黏度無明顯差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，添加細(xì)菌素未改變凝固型酸奶的流變學(xué)特性。

表1 貯藏過程中凝固型酸奶流變學(xué)參數(shù)的變化Table 1 Changes of set yogurt on rheological parameters during storage

（續(xù)表1）

2.6 凝固型酸奶貯藏過程中質(zhì)構(gòu)的變化

TPA 測(cè)定結(jié)果顯示，在凝固型酸奶貯藏過程中，各個(gè)樣品隨著貯藏時(shí)間的延長，硬度、黏附性、膠黏性、咀嚼性有所增長，內(nèi)聚性變化不大，各組樣品之間無顯著差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，添加細(xì)菌素未改變凝固型酸奶的質(zhì)構(gòu)特性。

2.7 凝固型酸奶貯藏過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化

表2～表4所示為不同處理組凝固型酸奶貯藏1，14，28 d 后揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量測(cè)定結(jié)果，可以看出，揮發(fā)性物質(zhì)含量總體在14 d 時(shí)上升到較高數(shù)值，隨后在28 d 下降。對(duì)于羰基化合物，檢測(cè)出了3-羥基-2-丁酮、丙酮、2-庚酮、2-壬酮、2-戊酮、2-已酮，酸奶中酮類化合物一般是由不飽和脂肪酸與氨基酸的分解以及微生物的代謝生成的，3-羥基-2-丁酮、2-壬酮是奶香氣味的主要來源[23]。發(fā)酵乳中檢測(cè)到醇類物質(zhì)有異辛醇、2-乙基己醇、二甲基丁醇、己二醇，且集中在貯藏28 d 后才檢測(cè)出來。醇類物質(zhì)一般由于糖類、氨基酸和醛類物質(zhì)發(fā)生還原反應(yīng)而產(chǎn)生。然而，因醇類物質(zhì)的閾值較高，所以對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的影響較低[24]。發(fā)酵乳中檢測(cè)到的酯類物質(zhì)有乙酸乙酯、乙酸丁酯，其也在14 d 時(shí)含量較高，能夠豐富發(fā)酵乳的口感。酸類物質(zhì)能夠使酸奶口感更為清爽，香氣更加濃郁，是構(gòu)成發(fā)酵乳特征風(fēng)味的主要物質(zhì)[25]。在樣品中檢測(cè)出戊酸、丙酸、丁酸、辛酸、己酸、羧酸。此外，還檢測(cè)出苯與甲苯等芳香物質(zhì)。對(duì)比同時(shí)期的不同處理組，添加56 mg/mL bifidocin A 組、添加28 mg/mL bifidocin A 組和添加50 mg/mL 乳酸鏈球菌素組中，有良好滋氣味的揮發(fā)性化合物含量明顯多于其它處理組（P<0.05）。

表2 凝固型酸奶貯藏1 d 后揮發(fā)性物質(zhì)的種類Table 2 Types of set yogurt of volatile substances after storage for 1 d

（續(xù)表2）

表3 凝固型酸奶貯藏14 d 后揮發(fā)性物質(zhì)的種類Table 3 Types of set yogurt of volatile substances after storage for 14 d

表4 凝固型酸奶貯藏28 d 后揮發(fā)性物質(zhì)的種類Table 4 Types of set yogurt of volatile substances after storage for 28 d

（續(xù)表4）

3 結(jié)論

本研究在商業(yè)凝固型酸奶發(fā)酵劑基礎(chǔ)上分別添加乳酸鏈球菌素和新型雙歧桿菌細(xì)菌素bifidocin A，通過對(duì)比分析不同處理組貯藏28 d 過程中酸度、pH、持水力、活菌數(shù)的變化，以及影響品質(zhì)指標(biāo)中的持水力、質(zhì)構(gòu)性、流變特性及可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)添加28 mg/mL bifidocin A 組與已被世界衛(wèi)生組織認(rèn)可的添加50 mg/mL 乳酸鏈球菌素組對(duì)凝固型酸奶后酸化的抑制效果最為相近，同時(shí)可確保酸奶保質(zhì)期達(dá)到28 d，并明顯改善凝固型酸奶的感官品質(zhì)，提高其持水力和風(fēng)味物質(zhì)的保存量?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，基本確定添加終濃度為28 mg/mL bifidocin A 到凝固型酸奶中可替代乳酸鏈球菌素，有效解決凝固型酸奶貯藏過程中后酸化的問題，并可在一定程度上改善酸奶的感官品質(zhì)，顯示出細(xì)菌素bifidocin A 作為新型天然食品生物防腐劑的巨大潛力。