酶法催化制備酥油基母乳脂肪替代脂

陳 芳 葉玉蘭 熊 華 胡蔣寧 朱雪梅*

（1 南昌大學食品學院 食品科學與技術國家重點實驗室 南昌330047 2 大連工業(yè)大學食品學院 國家海洋食品工程技術研究中心 遼寧大連116034）

對于嬰兒來說，母乳是最好的營養(yǎng)來源[1]。母乳是一種復雜的天然食物，一般成分為87%的水，3.8%的脂肪，1.0%的蛋白質(zhì)和7%的乳糖。除了為體細胞生長提供營養(yǎng)之外，母乳還含有多種生物活性成分，這些分子具有不同的作用，包括參與嬰兒免疫系統(tǒng)發(fā)育，大腦發(fā)育，腸道微生物群的發(fā)展[2]。母乳脂肪約提供母乳40%～55%的能量，脂肪中甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）含量占98%以上，主要脂肪酸包括棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和長鏈多不飽和脂肪酸花生四烯酸（Arachidonic acid，ARA）、二十二碳六烯酸（Docosahexenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（Eicosapentenoic acid，EPA）等[1-2]。母乳脂肪中棕櫚酸（Palmitic acid，P）總含量的60%～70%分布在中間位置，sn-1，3 位置則大都分布著油酸（Oleic acid，O），這種結構即圖1所示的1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（1，3-dioleoyl-2-palmitoylglycero，OPO）[3]。研究表明，脂肪在嬰幼兒體內(nèi)先經(jīng)sn-1，3 特異性脂肪酶的水解作用，將其水解為2-甘油單酯（Monoacylglycerol，MAG）和游離脂肪酸，游離脂肪酸在小腸中被吸收，MAG 通過淋巴系統(tǒng)進入血液循環(huán)[4]。MAG是大多數(shù)脂肪酸中一種較易被黏膜吸收的形式，容易與膽汁酸形成混合膠束，且不與二價陽離子形成不溶性皂[4]，然而，游離脂肪酸中人體只能消化吸收中短鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸，長鏈飽和脂肪酸棕櫚酸由于熔點高于體溫（63 ℃左右），不易被消化吸收，并且棕櫚酸在腸道中易與鈣結合形成鈣皂（P-Ca-P），導致鈣的吸收率降低。而母乳的脂肪結構可確保大量的棕櫚酸處于甘油三酯的中間位置上（OPO），易于吸收并且不會造成鈣的流失[5-6]。

在全球范圍內(nèi)，只有38%的嬰兒是純母乳喂養(yǎng)的[1]。由于生活方式、社會壓力、個人體質(zhì)等各種因素的影響，使母乳無法滿足嬰幼兒的生長發(fā)育要求，因此市場對嬰幼兒配方奶粉的需求仍在不斷擴大[7]。然而，大部分嬰兒奶粉的脂肪結構如圖1所示，與母乳OPO 結構相反，嬰幼兒對其脂肪的消化吸收率比母乳低20%～25%[8]；并且缺少促進嬰兒大腦發(fā)育的EPA，DHA，ARA等長鏈多不飽和脂肪酸。鑒于此，以母乳為模型，研究和開發(fā)母乳脂替代脂對保證嬰幼兒營養(yǎng)、健康發(fā)育及食品安全具有重要意義。

圖1 母乳和配方奶粉脂肪的代表甘油三酯結構Fig.1 Typical triacylglycerol structure of fat from human milk and infant formula

目前用于生產(chǎn)母乳脂肪替代脂（Human milk fat substitute，HMFS）的原料主要有3 大類，即三棕櫚酸甘油酯（PPP）、豬油及牛乳脂肪。Yang等[9]通過EPA 和DHA 乙酯為酰基供體，同PPP 在特異性脂肪酶TL IM 的催化作用下，合成含量為42%的ω-3 型脂肪酸；鄒孝強等[10]采用高熔點棕櫚油為原料，分別通過酶法酸解和物理混合，最終得到所得產(chǎn)品的棕櫚酸含量，sn-2 棕櫚酸含量以及sn-2 棕櫚酸的相對含量分別為23.5%，43.1%和61.1%，AA 和DHA 的含量分別為0.4%和0.3%。然而，由于國產(chǎn)棕櫚油較少，原料價格較貴，因此生產(chǎn)成本較高。豬油棕櫚酸大部分都分布在sn-2位置。Qin等[11]以豬油為原料，采用2 步法，即第1步以干法分提得到OPO 含量為30.7%的豬油分提物，第2 步采用來源于山茶油的脂肪酸為?；w，以脂肪酶RM IM 為催化劑酸解分提中間產(chǎn)物，得到OPO 含量為43.72%的產(chǎn)品。Yong等[12]以棕櫚仁油、茶籽油和大豆油的混合脂肪酸為酰基供體，同豬油在脂肪酶RM IM 的催化作用下酸解合成HMFS。由于一些民族特殊的宗教信仰，以豬油為原料生產(chǎn)的HMFS 在市場上難以通用。以牛乳為原料生產(chǎn)的HMFS，由于原料本身的性質(zhì)，所得產(chǎn)品同人乳脂肪有較大的差異，因此開發(fā)新原料合成HMFS 具有重要意義。

藏牦牛酥油（簡稱酥油）含有大量人體必需的常量和微量元素，其中對人體有益的Ca，Mg，F(xiàn)e，Cu，Zn，Mn，K，Na等8種營養(yǎng)元素較為豐富[13]。鄭玉才[14]分析酥油的脂肪酸，數(shù)據(jù)顯示含量最多的脂肪酸有C14∶0，C18∶1，C18∶0，C16∶0，其中油酸含量最高，約占總脂肪酸含量的30%[15]，且sn-2 位棕櫚酸的相對含量十分接近母乳。同時酥油還含有多種功能性脂肪酸，如：C18：2，C18：3，C20：4，CLA，C22：6，C20：5等[16]，具有增強記憶，促進嬰兒大腦發(fā)育和改善神經(jīng)傳導等功能。然而，酥油的脂肪酸結構和母乳具有一定差異，其亞油酸含量顯著低于母乳，需要對其進行修飾。目前國內(nèi)利用藏牦牛酥油制備母乳替代脂的研究較少。本文選用酥油作為主要原料，葵花籽油乙酯、油酸乙酯作為?；w，經(jīng)固定化脂肪酶（Lipozyme RM IM）催化酯交換合成HMFS。反應包括水解反應和酯化反應，然而，在水解反應中會產(chǎn)生酯交換反應的中間產(chǎn)物，即甘油二酯（Diacylglycerol，DAG），同時DAG 也是酰基遷移的中間產(chǎn)物。這個中間產(chǎn)物的生成會降低酶的活性，導致生成物的靶向性降低。本文通過單因素試驗和響應面試驗研究反應時間、溫度、底物比及酶水分活度因素對反應?；w移及亞油酸嵌入量的影響，檢測其主要脂肪酸組成，以期得到與母乳脂肪組成及結構更相似，功能更全面的母乳脂肪替代脂。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酥油，西藏寶信股份有限公司；葵花籽油，益海嘉里有限公司；Lipozyme RM IM，丹麥諾維信有限油脂有限公司；三羥甲基胺基甲烷（Tris），北京索萊寶科技有限公司；冰醋酸、無水硫酸鈉、無水乙醚、無水乙醇、石油醚、正己烷（分析純）、乙酸，天津市大茂化學試劑廠；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設備

BS 224S 型電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HP6890 氣相色譜儀，美國Agilent公司；KQ-50 超聲波發(fā)生器，昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9240 型電熱恒溫鼓風干燥箱，江西鼎技科學儀器有限公司；SHA-C 恒溫水浴振蕩器，金壇市榮華儀器制造有限公司；RV10 旋轉蒸發(fā)儀，德國IKA 集團。

1.3 方法

1.3.1 乙酯型脂肪酸的制備 稱取物質(zhì)的量比為1∶15 的葵花籽油和乙醇混合均勻，加入一定量KOH 作催化劑，在60 ℃下冷凝回流30 min。冷卻后將液體轉移至分液漏斗中，取上層有機相，水洗2 次，加入15 mL 乙醇促進分層，然后加入50 mL正己烷萃取，過無水硫酸鈉除水相，在45 ℃條件下旋轉蒸發(fā)有機溶劑，氮氣吹干。采用TLC 薄層色譜確認得到脂肪酸乙酯，所用擴展液為體積比90∶10∶1 的石油醚、乙醚及乙酸。

1.3.2 游離脂肪酸的制備 游離脂肪酸的制備參照文獻[17]的方法，主要步驟如下：向25 g 油中加入5.75 g KOH，加入11 mL 蒸餾水和66 mL 95%的乙醇，在80 ℃和200 r/min 條件下冷凝回流反應1 h。冷卻后，向體系中加入50 mL 的蒸餾水和100 mL 的正己烷，充分震蕩，除去含有未皂化物的有機相。采用3 mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)含有皂化物的無機相至pH 值為1，釋放脂肪酸。最后采用無水硫酸鈉對所得游離脂肪酸脫水處理。

1.3.3 酶法轉酯交換反應 將酥油與葵花籽油乙酯及油酸乙酯按一定比例混合，置于帶蓋的試管中，加入一定量固定化脂肪酶，充入氮氣后密封，將其放入恒溫水浴振蕩器中，保持轉速為200 r/min，恒定溫度下反應一段時間后終止反應，離心除去固定化脂肪酶，所得結構脂低溫保存以備分析。

1.3.4 單因素試驗 對底物物質(zhì)的量比（酥油：葵花籽油乙酯：油酸乙酯）、酶水活、反應溫度、反應時間等單因素進行考察，比較各個因素對產(chǎn)物中脂肪酸組成及分布的影響。

1.3.5 響應面設計 根據(jù)對反應影響因素的考察和篩選，在單因素試驗的基礎上，選取sn-2脂肪酸百分含量及總脂肪酸中亞油酸含量較高的水平進行響應面優(yōu)化試驗。根據(jù)Box-Behnken 試驗設計原理，運用 Design Expert 7.1 進行響應面設計。試驗因素編碼與水平設計見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Variables and levels in response surface design

1.3.6 甘油三酯的分離 在一定的時間內(nèi)從反應體系中取出100 mg 的樣品溶于正己烷中，采用TLC 薄層色譜分離純化得到甘油三酯，所用擴展液為體積比90∶10∶1 的石油醚、乙醚及乙酸。取出薄板置于碘蒸氣染色缸內(nèi)顯色處理。將相應的TAG 條帶刮下并置于25 mL 密封瓶中，添加乙醚提取TAG，吹干溶劑后加入2 mL 正己烷和1 mL甲醇鈉溶液（1 mol/L）。取出上層有機相并采用無水硫酸鈉脫水處理，最后采用氮氣濃縮有機相至200 μL，進氣相分析。

1.3.7 脂肪酸組成分析 參考文獻[18]分析總脂肪酸組成，稱取2～3 mg 樣品于螺口試管中，加入1.5 mL 正己烷，40 μL 乙酸甲酯，100 μL 甲醇化的甲醇鈉（0.5 mol/L），置于37 ℃水浴反應30 min，放入冰箱冷凍10 min，迅速加入60 μL 的飽和草酸溶液，離心除去沉淀。取試管內(nèi)混合物的上層清液；上清液經(jīng)無水硫酸鈉柱子脫水；將樣品經(jīng)N2吹干，經(jīng)正己烷稀釋；用1 mL 注射器吸取溶液過濾顆粒；用于GC 分析。

氣相色譜條件參照趙曼麗[19]：采用Agilent 公司帶全自動進樣系統(tǒng)6890 型氣相色譜儀，F(xiàn)ID 檢測器，分析柱為CP-Sil88 石英毛細管柱（100 m×12.5 mm）；載氣為H2；柱頭壓力為24.52 psi；進樣口溫度為250 ℃；程序升溫：45 ℃條件下保持4 min；以13 ℃/min 的速度升溫至175 ℃，保持27 min；以4 ℃/min 的速度升溫至215 ℃，保持35 min；檢測時間86 min。利用面積歸一法得到各個脂肪酸的相對百分含量。

1.3.8 胰脂酶的水解 參考Luddy等[20]的方法，稱取10 mg 樣品于螺口試管中，依次加入2.5 mL膽鹽溶液（0.05%），1 mL CaCl2溶液（2.2%），10 mg胰脂酶和10 mL Tris-鹽酸緩沖液（1 mol/L），振蕩2 min，置于37 ℃中水浴反應20 min，期間取出振蕩1 次。待反應結束后取出冷卻，加入5 mL 無水乙醚振蕩1 min，取上清液過無水硫酸鈉柱子，氮氣吹干備用。

向樣品中加入約1 mL 正己烷復溶，通過薄層色譜展開法（TLC）進行MAG 分離，展開劑體積比為正己烷∶乙醚∶乙酸＝50∶50∶1。采用碘蒸汽顯色。刮下MAG 條帶，甲酯化儲存于-18 ℃，用于氣相分析。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸分析結果

由表2可知，葵花籽油乙酯中含量最高的脂肪酸為亞油酸（62.28%），其次為油酸（26.00%）。在油酸乙酯中，油酸含量最高為47.97%，其次為亞油酸（41.22%）。與母乳脂肪酸范圍相比，酥油中亞油酸含量較低，因此本文選用葵花籽油乙酯和油酸乙酯，以期對酥油脂肪酸組成進行一定程度的調(diào)整。

表2 試驗原料脂肪酸組成分析Table 2 Analysis of materials’ fatty acid composition

2.2 酰基供體選擇

由圖2可知，當以脂肪酸乙酯作為酰基供體時，肉豆蔻酸含量為9.1%，棕櫚酸含量為25.53%，硬脂酸含量為11.93%，油酸含量為25.94%，亞油酸含量為11.62%，亞麻酸含量為0.89%。當以游離脂肪酸作為?；w時，肉豆蔻酸含量為8.89%，棕櫚酸含量為26.43%，硬脂酸含量為13.23%，油酸含量為26.87%，亞油酸含量為10.58%，亞麻酸含量為0.84%。比較總脂肪酸含量可知，以脂肪酸乙酯或游離脂肪酸作為?；w時差異不顯著。然而以游離脂肪酸作為?；w時，其油酸含量超出母乳脂肪酸范圍，其它種類脂肪酸含量均在范圍之中。

由圖3 及表2 中母乳相應脂肪酸范圍可以知，以脂肪酸乙酯作為?；w時，sn-2 棕櫚酸相對含量為49.17%，高于以游離脂肪酸作為酰基供體時sn-2 棕櫚酸相對含量（48.68%）。由圖2～3可知，以脂肪酸乙酯作為?；w時，可以最大限度的保留原底物的脂肪酸組成分布，即可控制?；w移從而得到與母乳脂肪酸組成最為相似的終產(chǎn)物，故試驗選用脂肪酸乙酯作為酰基供體。

圖2 酰基供體類型對產(chǎn)物總脂肪酸含量的影響Fig.2 The effects of acyl donor on total fatty acid content

圖3 ?；w類型對產(chǎn)物sn-2 棕櫚酸相對含量的影響Fig.3 The effects of acyl donor on relative content of sn-2 palmitic acid

2.3 單因素試驗

2.3.1 時間對酶法酯交換反應的影響 圖4a 表示在反應溫度為60 ℃，底物物質(zhì)的量比為酥油：葵花籽油乙酯∶油酸乙酯=2∶1∶1，加酶量為10%（以反應底物重量計），水分含量為0.5 時，反應時間對各脂肪酸含量的影響。由圖4a可知，隨著反應時間延長，總棕櫚酸和sn-2 棕櫚酸相對含量逐漸降低下降至23%，反應4 h 后sn-2 棕櫚酸含量降低至50%，sn-2 棕櫚酸的降低可能是因為反應時間過長使得酰基遷移程度增加。總棕櫚酸含量下降可能是由于sn-2 棕櫚酸含量減少也可能是由于已經(jīng)鍵入亞油酸和油酸，與圖4b 結果一致。為得到終產(chǎn)物中較高sn-2 棕櫚酸含量，反應時間應控制在4 h 左右。由圖4b可知，油酸及亞油酸含量在最初2 h 內(nèi)迅速升高，并在4 h 左右達到平衡。其它脂肪酸如硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸及亞麻酸含量緩慢增加，均在2 h 就已達到平衡?？紤]到酶促酯交換反應終產(chǎn)物中各脂肪酸含量還受溫度、底物比、水分含量以及各因素交互作用的影響，因此，試驗確定反應時間在2～4 h 范圍內(nèi)。

圖4 反應時間對各脂肪酸含量的影響Fig.4 The effects of reaction time on the contents of fatty acids

2.3.2 溫度對酶法酯交換反應的影響 圖5 表示的是在加酶量為10%（占反應底物的百分比），酶水分含量為0.5，反應時間為3 h，底物物質(zhì)的量比為酥油∶葵花籽油乙酯∶油酸乙酯=2∶1∶1 時，不同反應溫度對產(chǎn)物中各脂肪酸含量的影響。由圖5a可知，在反應時間內(nèi)，sn-2 棕櫚酸含量隨溫度的升高而迅速降低，這是因為高溫可以促進酰基遷移，導致sn-2 位上的棕櫚酸轉移到sn-1，3 位上，使sn-2 棕櫚酸的含量降低。然而在溫度為65 ℃時，產(chǎn)物中總棕櫚酸含量為24%，sn-2 棕櫚酸含量為55.0%，基本達到試驗目標。由于較高的溫度將會加快酶的變性速率，故試驗選擇溫度區(qū)間為50～70 ℃。由圖5b可知，各脂肪酸含量變化不大。

圖5 反應溫度對各脂肪酸含量的影響Fig.5 The effects of temperature on the contents of fatty acids

2.3.3 水分活度對酶法酯交換反應的影響 圖6表示的是在反應溫度為60 ℃，加酶量為10%（占反應底物的百分比），底物物質(zhì)的量比為酥油∶葵花籽油乙酯∶油酸乙酯=2∶1∶1，反應時間為3 h時，不同水分含量（占酶質(zhì)量的百分比）對產(chǎn)物中各脂肪酸含量的影響。由圖6a可以看出，隨著酶中含水量增加，產(chǎn)物中總棕櫚酸的含量及sn-2 棕櫚酸的含量均呈降低趨勢。脂肪酶RM IM是水分子依賴性酶，水活越高RM IM 的催化活性越強，即一定時間內(nèi)酯化和水解能力越強，也會有更多副反應酰基遷移，因此在圖6a，6b 中水分活度越高則鍵入油酸及亞油酸越多，同理總棕櫚酸和sn-2 棕櫚酸含量越少。因此，優(yōu)化反應中將酶的水分含量設定在0.2～0.8 之間。

圖6 水分活度對各脂肪酸含量的影響Fig.6 The effects of water content on the contents of fatty acids

2.3.4 底物物質(zhì)的量比對酶法酯交換反應的影響圖7 表示在反應溫度為60 ℃，反應時間為3 h，加酶量為10%（占反應底物的質(zhì)量百分比），酶水分含量為0.5 時，不同底物物質(zhì)的量比對產(chǎn)物中各脂肪酸含量的影響。

由圖7a 看出，隨著底物物質(zhì)的量比增加，產(chǎn)物中總棕櫚酸的含量逐步降低，由底物物質(zhì)的量比為1∶1∶1 時的23.5%升至4∶1∶1 的28%，同時sn-2 棕櫚酸的含量也隨著底物物質(zhì)的量比的增大而升高，由底物物質(zhì)的量比為1∶1∶1 時的58.56%降低至4∶1∶1 的54.67%。由圖7b可知，隨著酥油比例增加，總棕櫚酸和sn-2 棕櫚酸的含量有上升趨勢，而亞油酸和油酸含量卻在逐漸下降，這是由于酥油比例增大油酸和亞油酸在底物中比例降低所致。故為保證終產(chǎn)物中sn-2 棕櫚酸的含量以及亞油酸和油酸含量，底物物質(zhì)的量比區(qū)間設置在1∶1∶1 和3∶1∶1 之間。

圖7 底物物質(zhì)的量比對各脂肪酸含量的影響Fig.7 The effects of substances ratio of the amount of substrate on the contents of fatty acids

2.4 響應曲面數(shù)據(jù)分析

2.4.1 響應面試驗設計及結果 如表3所示，在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法優(yōu)化反應條件。綜合考慮，優(yōu)化試驗選擇總亞油酸含量及sn-2 棕櫚酸相對含量為主要指標，在此優(yōu)化過程中只測定不報告。試驗采用Box-Behnken 設計，共考慮4 因素3 水平，包括反應時間（2～6 h）、溫度（50～70 ℃）、酶水活（0.2～0.8）、底物物質(zhì)的量比（1～3）。

由表4可知，對于響應值總亞油酸含量，一次項系數(shù)酶水活和底物物質(zhì)的量比為負數(shù)，即對響應值為負面影響。二次項系數(shù)中只有水分活度×水分活度為負面影響。在交互作用的影響中，只有水分活度×底物物質(zhì)的量比對響應值影響不為負，其它均為負面影響。模型擬合響應值亞油酸含量，能夠解釋絕大多數(shù)響應值的變化，其P 值小于0.0001，這說明該模型高度顯著。由表5可知，對于響應值sn-2 棕櫚酸相對含量（%），一次項系數(shù)時間為負數(shù)，即對響應值為負面影響。二次項系數(shù)均為負面影響。在交互作用的影響中，只有時間×底物物質(zhì)的量比、水分活度×底物物質(zhì)的量比對響應值影響不為負，其它均為負面影響。模型擬合響應值sn-2棕櫚酸相對含量，能夠解釋絕大多數(shù)響應值的變化，其P 值小于0.0001，這說明該模型高度顯著。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface experimental design and results

表4 R2 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of R2 for each item of regression equation developed

表5 R1 回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of R1 for each item of regression equation developed

通過以上分析，最終確定描述sn-2 棕櫚酸相對含量以及總亞油酸含量變化的二次多項式模型如下所示：

R1=57.54+1.99A-1.25B+0.26C+0.16D+0.53AB+0.16AC+0.39AD+1.01BC-1.90BD-1.23CD-1.13A2-1.37B2-2.64C2-3.95D2

R2=12.57+0.91A+0.36B-0.33C-4.11D-0.14AB-0.28AC-1.11AD-0.034BC-0.64BD+0.74CD+0.035A2+0.5B2+0.086C2+1.53D2

式中，R1——sn-2 棕櫚酸相對含量預測值；R2——總亞油酸含量預測值；A，B，C，D 分別為變量反應溫度、時間、酶水分活度、底物物質(zhì)的量比。

由圖8可知，預測值與實際值有良好的線性關系，2 個響應值R1，R2決定系數(shù)及矯正決定系數(shù)分別為0.9785，0.9569，0.9785，0.9570，代表該模型能夠說明響應值同各獨立影響因素之間的關系。

圖8 預測值同測定值的關系Fig.8 Relationship between the observed and predicted values

反應溫度、酶水分活度、底物物質(zhì)的量比、反應時間之間的相互作用對酶解反應中產(chǎn)品總亞油酸含量的影響如圖9a～d所示。由圖9a可知，總亞油酸含量隨反應溫度的上升而上升，這主要是因為較高溫度有助于酯交換反應發(fā)生。然而，較高的溫度將會增加酶變性的速率以及一些副反應的發(fā)生如酰基轉移。因此，有必要將溫度控制在一個合適的范圍之內(nèi)。由圖9c可知，酶水活由0.5 增加至0.8 時總亞油酸含量從12.64%下降到12.38%，原因可能是較高的水分活度促進副反應的發(fā)生。

圖9 任意2 個因素對總亞油酸含量影響的等高線圖Fig.9 Response contour plots between two parameters for the total content of linoleic acid

反應溫度、酶水分活度、底物物質(zhì)的量比、反應時間之間的相互作用對酶解反應產(chǎn)品總亞油酸含量的影響如圖10a～d所示。由圖10a可知，隨著反應溫度升高，sn-2 棕櫚酸含量緩慢的增加。這是由于高溫條件下酰基遷移速度加快，該過程遵循熱動力學原理。同時，隨著反應時間增加，sn-2 棕櫚酸含量逐漸降低，這是由于反應時間延長使得更多副反應發(fā)生導致DAG 生成量增加所致。由圖10b可知，sn-2 棕櫚酸相對含量隨著酶水分活度的增加呈先上升后下降的趨勢，這是由于酶在最適水活下，可以起到較好的催化作用，減少副反應發(fā)生。

圖10 任意2 個因素對sn-2 棕櫚酸相對含量影響的等高線圖Fig.10 Response contour plots between two parameters on the relative content of sn-2 palmitic acid

為獲得總亞油酸含量大于15%，sn-2 棕櫚酸相對含量大于50%的終產(chǎn)物，通過Design expert的優(yōu)化功能，經(jīng)過比較分析，確定最優(yōu)條件為：反應時間，5.7 h；溫度，68 ℃；底物物質(zhì)的量比，酥油：葵花籽油乙酯：油酸乙酯=2.13∶1∶1；酶水活，0.61；加酶量，10%。在此條件下，產(chǎn)品的總亞油酸以及sn-2 棕櫚酸相對含量的預測值分別為17.89%和56.21%。

對模型進行優(yōu)化條件下的驗證，終產(chǎn)物中脂肪酸含量及分布如表6所示。在反應時間，5.7 h；溫度，68 ℃；底物物質(zhì)的量比，酥油：葵花籽油乙酯：油酸乙酯=2.13∶1∶1；酶水活，0.61；加酶量，10%的條件下，產(chǎn)品中總亞油酸以及sn-2 棕櫚酸相對含量的實際值分別為17.59%和56.40%。與預測值基本一致，證明模型具有較高的準確性。

表6 優(yōu)化條件下的結構脂的脂肪酸組成及分布Table 6 Fatty acid composition and positional distribution of structured lipids produced under optimum conditions

3 結論

本文采用酶法催化法，固定化脂肪酶RM IM催化，制備HMFS，試驗原料選用與母乳脂肪相似度較高的酥油，并通過酶法催化對其結構進行修飾，以期得到脂肪組成及結構與母乳最為相似的替代脂。得到結論主要如下：

1）在選用?；w時發(fā)現(xiàn)，脂肪酸乙酯較比游離脂肪酸具有更好的性質(zhì)，能有效減少一些副反應的發(fā)生，從而使終產(chǎn)物的合成更具目標性。

2）運用響應曲面法優(yōu)化酶法催化反應條件，得到最佳工藝條件為：反應時間5.7 h，溫度68℃，底物物質(zhì)的量比為酥油：葵花籽油乙酯：油酸乙酯=2.13∶1∶1，酶水活0.61，加酶量10%。并在模型驗證中得到終產(chǎn)物總亞油酸以及sn-2 棕櫚酸相對含量的實際值分別為17.59%和56.40%，與預測值基本一致，合成終產(chǎn)品與母乳脂肪結構較為類似。本研究為模擬母乳脂肪提供了新的可能性。