小鼠骨髓源肥大細(xì)胞外泌體對(duì)肝癌Hepa1-6細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

王小冬，楊木清，劉 斌，鄧現(xiàn)語(yǔ)，劉 穎，音洋洋，李濟(jì)宇

肥大細(xì)胞來(lái)源于骨髓的造血干細(xì)胞，主要分布于皮膚、呼吸道和消化道的結(jié)締組織中，其不僅參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，還能調(diào)節(jié)血管生成和神經(jīng)傳導(dǎo)[1-2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)量與疾病的預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。

外泌體是細(xì)胞通過(guò)內(nèi)體途徑分泌到胞外的納米級(jí)囊泡[5]。研究[6-7]表明外泌體能夠在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移其內(nèi)容物，包括RNA，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等。最新研究[8]發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞除了分泌組胺、肝素和細(xì)胞因子外還釋放其他生物活性物質(zhì)-外泌體。然而，關(guān)于骨髓源肥大細(xì)胞外泌體的提取與鑒定尚未有報(bào)道。此外，骨髓源肥大細(xì)胞外泌體是否參與調(diào)控肝癌的生長(zhǎng)尚不清楚，因此，該研究旨在探討骨髓源肥大細(xì)胞外泌體對(duì)肝癌Hepa1-6細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，為進(jìn)一步探索其在肝癌的發(fā)生發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物 小鼠肝癌細(xì)胞(Hepa1-6)購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；C57/BL6小鼠，雄性8只，體質(zhì)量(20±2) g，購(gòu)自上海斯萊克生物有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；去外泌體胎牛血清(24 000 r/min，18 h)；小鼠重組白細(xì)胞介素( interleukin，IL)-3，干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF)(美國(guó)Peprotech公司)；PE-CD117、FITC-FcεRIα(美國(guó)eBioscience公司)；雙抗(青霉素和鏈霉素)和Edu試劑盒(上海碧云天生物公司)；PKH67染料(美國(guó)Sigma公司)；CCK-8試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒和甲苯胺藍(lán)(上海翊圣生物公司)；兔抗Alix 、兔抗TSG101、兔抗CD63 、兔抗Calnexin、鼠抗Tryptase (美國(guó)Abcam公司)；ECL化學(xué)發(fā)光顯影液 (美國(guó)Millipore公司)；Transwell 小室(美國(guó)Costar公司)；低溫高速冷凍離心機(jī) 、免疫熒光顯微鏡 (美國(guó)Thermo公司)；超速離心機(jī)、SW40水平轉(zhuǎn)頭 (美國(guó)Beckman公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1骨髓源肥大細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 剪取C57/BL6小鼠的股骨，去除股骨上的肌肉組織，并將骨骺端剪斷。用注射器吸取1640培養(yǎng)基，將小鼠骨髓沖出并收集細(xì)胞懸液，加入到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)含RPMI1640、10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素各100 U/ml、10 ng/ml IL-3和10 ng/ml SCF，平均6 d換1次液，5周左右分化成熟。

1.2.2骨髓源肥大細(xì)胞的鑒定 5周后收集培養(yǎng)細(xì)胞于離心管中，低速離心5 min，棄去上清液，并用PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，從中吸取100 μl于流式管中，分別加入0.5 μl的PE-CD117、0.2 μl的FITC-FcεRIα，避光孵育30 min，用PBS洗2次，行流式細(xì)胞分析。肥大細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色：用1%甲苯胺藍(lán)染液染色30 s，將染色的細(xì)胞懸液滴到防脫片上，超凈臺(tái)上風(fēng)干，并用2%的冰乙酸脫色，雙蒸水洗滌后，于光鏡下觀察。細(xì)胞免疫熒光染色：收集肥大細(xì)胞于EP管中，4%的多聚甲醛固定后，PBS洗3次，每次5 min，5%山羊血清和0.5%BSA室溫封閉1 h，離心后加入肥大細(xì)胞類胰蛋白酶(1 ∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入羊抗鼠熒光二抗(1 ∶1 000)，室溫孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min，最后DAPI染色，封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3骨髓源肥大細(xì)胞外泌體的分離純化 用去外泌體血清培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓源肥大細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞上清液，首先將細(xì)胞上清液以4 ℃，275 r/min離心10 min去除懸浮細(xì)胞；然后將細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，以4 ℃、1 836 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片；再將細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，以4 ℃、3 000 r/min離心30 min進(jìn)一步去除微囊泡；再用0.22 μm濾器過(guò)濾，分裝至6個(gè)體積為14 ml的超速離心管，以4 ℃、24 000 r/min離心70 min，小心吸取離心管上清液，用1 ml PBS吹打管底，并將各管中重懸的外泌體匯聚至1個(gè)14 ml超速離心管中，用PBS補(bǔ)足離心管3/4的體積，并在4 ℃、24 000 r/min 離心70 min，最后小心棄去上清液并用PBS重懸，凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.4骨髓源肥大細(xì)胞外泌體的鑒定

肝癌為臨床常見(jiàn)惡性腫瘤,發(fā)病隱匿,多數(shù)患者出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)已為晚期,5年存活率<10%。因此,肝癌早期診斷具有重要意義,甲胎蛋白(AFP)為臨床診斷肝癌的常見(jiàn)血清腫瘤標(biāo)記物,但其敏感性約39%~64%,特異性約為76%~91%,易出現(xiàn)誤診、漏診情況,給臨床診斷和治療帶來(lái)不便[1]。研究指出[2],肝癌組織因各因素導(dǎo)致PIVKA-II釋放入血,但其作用機(jī)制尚未完全明確。

1.2.4.1透射電鏡檢測(cè)外泌體 取少量外泌體5～10 μl， 并用PBS溶液稀釋10倍，吸取適量稀釋后的外泌體懸液于2 mm的銅網(wǎng)上，室溫靜置2 min后用濾紙將多余液體輕輕吸去，用4%醋酸雙氧鈾液室溫負(fù)染1 min，于透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.4.2粒徑檢測(cè)分析外泌體 使用Nanosight儀器測(cè)量提取的外泌體直徑大小。取新鮮適量樣品用PBS稀釋3 000倍，然后添加到納米孔中進(jìn)行測(cè)量，使用Nanosight儀器分析得到的外泌體顆粒大小。

1.2.4.3Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志性蛋白 每孔各加入外泌體樣品與細(xì)胞蛋白30 μg，于10% SDS-PAGE電泳至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，并稀釋一抗Alix(1 ∶1 000)、CD63(1 ∶1 000)、TSG101(1 ∶1 000)、Tryptase (1 ∶1 000)及Calnexin(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入羊抗兔二抗(1 ∶1 000)，溫室下孵育1 h，顯影。

1.2.5肝癌Hepa1-6細(xì)胞攝取骨髓源肥大細(xì)胞外泌體 將Hepa1-6細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔板中，10 μl PKH67標(biāo)記的外泌體加入到6孔板中，在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察攝取情況，并用熒光顯微鏡拍照。

1.2.6細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 使用CCK-8和Edu檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，將肝癌細(xì)胞以1×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)組分別用5、10、20 μg/ml濃度的骨髓源肥大細(xì)胞外泌體處理Hepa1-6細(xì)胞72 h, 對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基。向每孔中加入10 μl的CCK-8試劑，將細(xì)胞置于37 ℃中保持2 h。酶標(biāo)儀A450 nm測(cè)定吸光度(optical density,OD)。將肝癌細(xì)胞以1×105/孔接種于12孔板，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別用5、10、20 μg/ml濃度的骨髓源肥大細(xì)胞外泌體處理24 h，使用Edu試劑標(biāo)記增殖細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察并拍照計(jì)數(shù)。

1.2.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 用無(wú)菌槍頭垂直于6孔板的正中劃一條線，PBS洗去劃下的細(xì)胞，對(duì)照組加入等體積的正常培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入5、10、20 μg/ml的骨髓源肥大細(xì)胞外泌體。

1.2.8細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 使用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，將1×105個(gè)細(xì)胞接種到無(wú)血清培養(yǎng)基200 μl的上室內(nèi),下室加入500 μl含有5、10、20 μg/ml骨髓源肥大細(xì)胞外泌體的完全培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h。用75%的乙醇固定15 min，0.1%的結(jié)晶紫染色10 min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用軟件Image J進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示，組間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代骨髓源肥大細(xì)胞的鑒定5周后光鏡下觀察到成熟的骨髓源肥大細(xì)胞形態(tài)呈大小均一圓形，細(xì)胞膜邊緣有絲狀偽足突起；胞質(zhì)內(nèi)含有異染性顆粒。見(jiàn)圖1A。與甲苯胺藍(lán)結(jié)合后細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色，胞核染成藍(lán)色，表明獲得的肥大細(xì)胞具有吞噬甲苯胺藍(lán)的特性，鏡下統(tǒng)計(jì)超過(guò)95%的細(xì)胞都是成熟的肥大細(xì)胞。見(jiàn)圖1B。流式細(xì)胞儀分析得到CD117與FcεRIα雙陽(yáng)性的骨髓源肥大細(xì)胞比例達(dá)到95.1%，見(jiàn)圖1C、D,說(shuō)明獲得的肥大細(xì)胞具有較高的純度；細(xì)胞免疫熒光顯示：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有大量的被標(biāo)記的綠色熒光，即類胰蛋白酶陽(yáng)性的肥大細(xì)胞。見(jiàn)圖1E。

圖1 骨髓源肥大細(xì)胞鑒定A: 骨髓源肥大細(xì)胞光鏡圖 ×200；B: 骨髓源肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色 ×200；C、D：骨髓源肥大細(xì)胞流式鑒定同型對(duì)照?qǐng)D、陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D；E: 免疫熒光染色 ×400；1:DAPI;2:Tryptase;3:Merge

2.2 外泌體的鑒定骨髓源肥大細(xì)胞外泌體呈大小不均一的橢圓形或圓杯形，像“泄了氣的球形”結(jié)構(gòu)，且外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚，染色背景干凈，有完整的膜形結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖2A、B。Nanosight結(jié)果提示骨髓源肥大細(xì)胞外泌體的顆粒直徑在30～150 nm之間。見(jiàn)圖2C、D。Western blot驗(yàn)證顯示骨髓源肥大細(xì)胞外泌體表達(dá)Alix、CD63、Tryptase和TSG101蛋白，而Calnexin蛋白只在細(xì)胞中有表達(dá)。見(jiàn)圖2E。

2.3 肝癌Hepa1-6對(duì)骨髓源肥大細(xì)胞外泌體的攝取用PKH67試劑標(biāo)記骨髓源肥大細(xì)胞外泌體，將標(biāo)記后的外泌體與肝癌Hepa1-6細(xì)胞共培養(yǎng)，分別在0、6、24 h后，在熒光顯微鏡下觀察外泌體被肝癌細(xì)胞所攝取的情況，鏡下可見(jiàn)：隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Hepa1-6細(xì)胞核周?chē)奂耐饷隗w數(shù)量明顯增加,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示骨髓源肥大細(xì)胞外泌體可被Hepa1-6細(xì)胞攝取。見(jiàn)圖2F。

圖2 骨髓源肥大細(xì)胞外泌體鑒定及攝取情況A、B: 骨髓源肥大細(xì)胞外泌體透射電鏡圖 ×3 000；C、D: 粒徑檢測(cè)分析骨髓源肥大細(xì)胞外泌體濃度及顆粒分布 ×50；E: Western blot分析骨髓源肥大細(xì)胞外泌體蛋白(CD63、Alix、TSG101、Calnexin和Tryptase)表達(dá)；F: 不同時(shí)間肝癌Hepa1-6對(duì)骨髓源肥大細(xì)胞外泌體的攝取情況 ×200

2.4 骨髓源肥大細(xì)胞外泌體促進(jìn)肝癌Hepa1-6細(xì)胞增殖CCK-8和Edu實(shí)驗(yàn)?zāi)芎芎玫胤磻?yīng)細(xì)胞的增殖能力。采用其測(cè)定骨髓源肥大細(xì)胞外泌體對(duì)Hepa1-6細(xì)胞增殖的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，與對(duì)照組相比，濃度為10 μg/ml和20 μg/ml外泌體處理Hepa1-6細(xì)胞后在72 h測(cè)得OD值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.106,P<0.05；t=14.44,P<0.01)，而濃度為5 μg/ml時(shí)對(duì)Hepa1-6細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3A。Edu實(shí)驗(yàn)結(jié)果示Edu陽(yáng)性細(xì)胞比例5 μg/ml組為(40.2±1.64)%，10 μg/ml組(59±1.58)%，20 μg/ml組(84.8±2.86)%，與對(duì)照組(38.2±1.92)%相比，在低濃度為5 μg/ml時(shí)，其對(duì)Hepa1-6細(xì)胞增殖能力影響較弱，當(dāng)濃度為10 μg/ml和20 μg/ml時(shí)Hepa1-6細(xì)胞增殖能力明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，表明肥大細(xì)胞外泌體能夠促進(jìn)Hepa1-6細(xì)胞的增殖，并具有濃度依賴性。見(jiàn)圖3B。

圖3 不同濃度的骨髓源肥大細(xì)胞外泌體對(duì)Hepa1-6細(xì)胞增殖的影響A:CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況；B:Edu陽(yáng)性細(xì)胞 ×400；1:對(duì)照組；2:5 μg/ml組；3:10 μg/ml組；4:20 μg/ml組；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.5 骨髓源肥大細(xì)胞外泌體促進(jìn)肝癌Hepa1-6細(xì)胞遷移和侵襲劃痕實(shí)驗(yàn)用來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移能力(圖4A、B)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：5、10、20 μg/ml組細(xì)胞劃痕遷移率分別為(25.3±3.19)%、(41.4±2.07)%、(58.9±2.61)%，對(duì)照組劃痕遷移率為(20.2±2.28)%，當(dāng)5 μg/ml處理24 h后，Hepa1-6細(xì)胞遷移能力無(wú)明顯改變，當(dāng)濃度為10 μg/ml和20 μg/ml時(shí)，Hepa1-6細(xì)胞遷移效果明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨髓源肥大細(xì)胞外泌體對(duì)Hepa1-6細(xì)胞侵襲能力的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5、10、20 μg/ml組穿過(guò)基膜的細(xì)胞數(shù)分別為(46.4±3.51)、(76.2±4.60)、(97±5.24)個(gè)/視野，較對(duì)照組穿過(guò)基膜的細(xì)胞數(shù)(33.8±3.11)個(gè)/視野，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為<0.05，<0.05，<0.01)。見(jiàn)圖4C。表明肥大細(xì)胞外泌體對(duì)Hepa1-6細(xì)胞的遷移和侵襲能力具有促進(jìn)作用。

圖4 不同濃度的骨髓源肥大細(xì)胞外泌體對(duì)Hepa1-6細(xì)胞遷移和侵襲的影響 ×200A:0 h細(xì)胞劃痕觀察各組細(xì)胞的遷移情況；B: 24 h細(xì)胞劃痕觀察各組細(xì)胞的遷移情況；C:Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲情況；1:對(duì)照組；2:5 μg/ml組；3:10 μg/ml組；4:20 μg/ml組

3 討論

近年來(lái)，外泌體的功能得到廣泛關(guān)注。外泌體是由細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的胞外微小囊泡，作為一種活躍的生物容器，外泌體中含有多種蛋白質(zhì)、lncRNA和DNA等生物活性物質(zhì)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，外泌體作為細(xì)胞間通訊的載體，通過(guò)介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞間的相互作用，進(jìn)而在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、血管生成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。此外，研究[9]發(fā)現(xiàn)外泌體還可作為腫瘤的診斷標(biāo)志物、潛在的治療靶點(diǎn)以及藥物遞送系統(tǒng)。

肥大細(xì)胞源于骨髓中的骨髓祖細(xì)胞，并遷移至周?chē)M織中分化成熟[10]。肥大細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的第一道防線，除在過(guò)敏反應(yīng)中起主導(dǎo)作用外，還與免疫、炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Lotvall et al[11]首先在肥大細(xì)胞分泌的外泌體中發(fā)現(xiàn)有功能性RNA，這類外泌體RNA具有在細(xì)胞之間的傳遞和轉(zhuǎn)移信息的作用。此外，肥大細(xì)胞系HMC-1分泌的KIT蛋白，通過(guò)外泌體與腫瘤細(xì)胞相互作用，隨后激活胞內(nèi)KIT-SCF信號(hào)通路，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖[12]。但是，關(guān)于骨髓來(lái)源的肥大細(xì)胞分泌的外泌體研究甚少。本研究探討了骨髓源肥大細(xì)胞外泌體對(duì)肝癌Hepa1-6細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響。采用超速離心法從小鼠骨髓源肥大細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取外泌體，以濃度梯度的方式處理肝癌細(xì)胞Hepa1-6，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、Edu實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，當(dāng)外泌體濃度為10 μg/ml時(shí)，骨髓源肥大細(xì)胞分泌的外泌體能夠明顯促進(jìn)肝癌Hepa1-6細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。這為后續(xù)進(jìn)一步探索肥大細(xì)胞外泌體在肝癌中的相關(guān)機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

目前，外泌體的提取方法有很多，包括基于超速離心的分離、免疫學(xué)分離、超濾分離和基于聚合物的沉淀分離等[13]，但并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，其中超速離心是目前應(yīng)用最廣泛的外泌體提取方法，超速離心法除了操作簡(jiǎn)單、成本低、外泌體純度高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)提取的外泌體能夠保留完整的囊泡結(jié)構(gòu)，并能保持其表面蛋白的特異性和mRNA成分的活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超速離心法從肥大細(xì)胞上清中提取外泌體，并通過(guò)透射電鏡觀察，Nanosight粒徑分析和Western blot檢測(cè)標(biāo)志蛋白均證實(shí)為外泌體。