基于TLR4/NF-κB信號(hào)通路探討托里消毒散治療放射性直腸炎的作用機(jī)制

祝朝富，安佰平，黃洪婕，杜 馳，吳勇俊，藍(lán) 蘭，李 丹，雷冬梅，李世杰，敖 睿

放射性直腸炎(radiation-induced proctitis，RIP)是接受放射治療患者最常見(jiàn)的臨床問(wèn)題[1]。放射治療后腸道功能障礙的人數(shù)持續(xù)增加，報(bào)道[2]顯示接受前列腺癌放射治療的患者中有75%以上發(fā)生急性RIP。目前對(duì)RIP的治療是反應(yīng)性的，通常只在RIP發(fā)作后才給藥。治療方法如硫糖鋁、5-氨基水楊酸等經(jīng)常不能顯著改善患者的生活質(zhì)量，甚至在極少數(shù)情況下被證明會(huì)加重疾病。在利用外科干預(yù)如激光消融、電灼、硬化注射等方面，都具有發(fā)病率和死亡率的重大風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，需要一種非侵入性預(yù)防性治療，以防止RIP的發(fā)生或?qū)Y狀改善到不會(huì)影響患者生活質(zhì)量的水平。中醫(yī)藥在治療放射性直腸損傷中的作用更加突出，在預(yù)防和治療方面更能體現(xiàn)其不可比擬的優(yōu)越性[4]。因此，該研究考察托里消毒散對(duì)放射性直腸炎的作用效果及機(jī)制，為放射性直腸炎的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物與分組 成年雌性SD大鼠48只，體質(zhì)量(210±10)g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，使用許可證號(hào)：SYXK(川)2014-189。飼養(yǎng)于恒溫(20～25 ℃)、恒濕(50%±5%)環(huán)境中，自然采光，自由飲水，飼以條桿狀動(dòng)物飼料。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為6組：空白組(未放療+生理鹽水)、模型組(放療+生理鹽水)、蒙脫石散聯(lián)合地塞米松組(放療+蒙脫石散+地塞米松)、托里消毒散低劑量組(放療+托里消毒散低劑量)、托里消毒散中劑量組(放療+托里消毒散中劑量)、托里消毒散高劑量組(放療+托里消毒散高劑量)，每組8只，本研究選擇在大鼠放療前12 h禁食。

1.1.2試劑 地塞米松(國(guó)藥準(zhǔn)字H41021255)購(gòu)自天津藥業(yè)集團(tuán)；蒙脫石散(國(guó)藥準(zhǔn)字H20000690)購(gòu)自博福-益普生天津制藥有限公司；干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(貨號(hào)：ZC-36294)、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)(貨號(hào)：ZC-37624)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)(貨號(hào)：ZC-36402)、IL-10(貨號(hào)：ZC-36379)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)(貨號(hào)：ZC-36425)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)(貨號(hào)：ZC-37000)、IgM(貨號(hào)：ZC-37006)、IgG(貨號(hào)：ZC-37002)試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司；TRIzol 試劑RNA提取試劑盒(批號(hào)：14105)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PCR擴(kuò)增試劑盒(批號(hào)：AK9906)購(gòu)自日本TaKaRa公司；TLR4(貨號(hào)：ab217274)、Myd88(貨號(hào)：ab2064)、IκBα(貨號(hào)：ab7217)相關(guān)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；NF-κB p65(批號(hào)：10745-1-AP)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；β-actin(批號(hào)：MABT825)購(gòu)自德國(guó)Merckmillipore公司；蛋白定量試劑盒(BCA法)購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.2 大鼠放射性直腸炎模型構(gòu)建參照文獻(xiàn)[5]采用盆腔局部單次大劑量照射的方法建立放射性直腸炎大鼠動(dòng)物模型。除空白組外的其余大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉。待大鼠肌淺反射消失，完全松弛后，以仰臥體位固定在自制塑料板上，以6MV-X線直線加速器照射。照射范圍自恥骨聯(lián)合至肛門，放射野面積30 cm×20 cm，兩側(cè)放空，放療區(qū)覆蓋0.5 cm厚補(bǔ)償膜，源皮距100 cm，開(kāi)機(jī)劑量1 600 mu。照射完畢，等待動(dòng)物全部蘇醒后，送返實(shí)驗(yàn)中心繼續(xù)飼養(yǎng)?？瞻捉M小鼠置于相似環(huán)境中，但不予照射。以造模后大鼠出現(xiàn)稀便、黏液便或柏油樣便判定造模成功。

1.3 藥物的制備托里消毒散：生曬參15 g、黃芪30 g、當(dāng)歸15 g、川芎15 g、白芍15 g、炒白術(shù)15 g、茯苓30 g、白芷15 g、皂角刺15 g、金銀花15 g，炙甘草6 g。方劑來(lái)源明代陳實(shí)功所著《外科正宗》[6]，所有中藥均由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房統(tǒng)一采供招標(biāo)，所有中藥均符合國(guó)家藥典要求。因采用灌腸方式，遂將散劑制備成濃縮湯劑，按組方稱取藥材，先加372 ml蒸餾水，浸泡30 min，后使用砂鍋將其大火煮開(kāi)，進(jìn)行第一次煎煮，大火10 min，后小火煮50 min，冷卻，過(guò)濾，留取濾液；再將煎煮過(guò)的藥渣放入砂鍋，加入930 ml蒸餾水，進(jìn)行第二次煎煮，大火煮開(kāi)，持續(xù)10 min，后小火煮50 min，冷卻，過(guò)濾，留取濾液；將第一次煎的濾液和第二次煎的濾液合并放入燒杯，小火加熱，進(jìn)行濃縮，濃縮至93 ml，即含生藥2 g/ml溶液。同理，制備含生藥1 g/ml和4 g/ml 溶液。冷卻，裝入密封袋中，4 ℃冷藏備用。地塞米松(天津藥業(yè)集團(tuán)，國(guó)藥準(zhǔn)字H41021255)加入蒸餾水稀釋至1 mg/ml，蒙脫石散(博福-益普生天津制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20000690)加入蒸餾水溶解為0.2 g/ml。

1.4 給藥方法造模成功后大鼠正常喂養(yǎng)3 d后，開(kāi)始灌腸，每天灌腸1次，連續(xù)10 d?？瞻捉M、模型組：生理鹽水(0.9% NS)2 ml灌腸；蒙脫石散聯(lián)合地塞米松組：蒙脫石散(0.2 g/ml)聯(lián)合地塞米松(1 mg/ml)2 ml灌腸；托里消毒散低劑量組：托里消毒散低劑量(含生藥1 g/ml)2 ml灌腸；托里消毒散中劑量組：托里消毒散中劑量(含生藥2 g/ml)2 ml灌腸；托里消毒散高劑量組：托里消毒散高劑量(含生藥4 g/ml)2 ml灌腸。

1.5 樣本采集血樣采集：尾靜脈抽取4 ml，3 000 r/min低溫離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存。直腸組織采集：處死所有大鼠，離斷大鼠直腸，將直腸分為2部分，距肛門2 cm～1 cm段直腸浸泡于4%的多聚甲醛液體，用于做HE染色檢查。距肛門1 cm以下段直腸放入DEPC處理過(guò)的1.5 ml EP管中，凍存于-80 ℃冰箱，留待做炎癥因子的Wester blot及qRT-PCR檢測(cè)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1體質(zhì)量變化 給藥開(kāi)始后所有大鼠每隔2 d測(cè)體質(zhì)量1次，觀察體質(zhì)量變化。

1.6.2大鼠直腸直徑的檢測(cè) 大鼠處死后以游標(biāo)卡尺檢測(cè)大鼠距肛門1 cm以上大鼠的直腸直徑。

1.6.3組織病理學(xué)觀察 將固定的直腸組織按常規(guī)方法制備石蠟切片，HE染色，鏡檢觀察。采用打分法記分放射性直腸炎腺體減少，以大鼠直腸黏膜腺體減少的程度作為評(píng)判炎癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)：腺體正常為0分，腺體減少<25%為1分，腺體減少≥25%～50%為2分，腺體減少≥50%～75%為3分，腺體減少>75%為4分。

1.6.4ELISA檢測(cè)血清因子 按照試劑盒說(shuō)明操作，采用ELISA試劑盒(上海茁彩)檢測(cè)血清IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、EGF水平，檢測(cè)血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG水平。

1.6.5Western blot檢測(cè) 用RIPA裂解液從直腸組織中提取總蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，并用蛋白上樣緩沖液(5×)變性樣品，樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用等量蛋白質(zhì)上樣，選擇10%的SDS-PAGE進(jìn)行分離，分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，封閉結(jié)束后按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕Y(jié)合一抗TLR4、Myd88、IκBα，NF-κB p65，β-actin均按1 ∶500稀釋，4 ℃孵育過(guò)夜后TBST清洗，然后根據(jù)一抗來(lái)源選擇合適的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST清洗，ECL暗室顯色。顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin為內(nèi)參，陰性對(duì)照組目標(biāo)蛋白質(zhì)相對(duì)含量為1，計(jì)算各組蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.6qRT-PCR檢測(cè) qRT-PCR檢測(cè)各組直腸組織中TLR4、Myd88、NF-κBp65、IL-6、IL-10 mRNA表達(dá)，采用RNA提取試劑盒提取直腸組織總RNA，測(cè)定A260和A280吸光度值，電泳確定RNA的完整性后，依據(jù)mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，合成cDNA，采用SYBR GreenⅠreal-time PCR的方法檢測(cè)mRNA的相對(duì)表達(dá)量，U6作為內(nèi)參。PCR循環(huán)條件為95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s；40個(gè)循環(huán)。記錄Ct值，并采用2-ΔΔCt法分析直腸組織TLR4、Myd88、NF-κBp65、IL-6、IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量變化模型組第1、5、7、10天的體質(zhì)量均低于空白組(P<0.01)，與模型組相比，托里消毒散中、高劑量組大鼠體質(zhì)量明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠體質(zhì)量變化

2.2 大鼠直腸變化

2.2.1大鼠直腸病理組織觀察 與空白組比較，模型組直腸組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度病變，黏膜被覆上皮不同程度變性、脫落、壞死，血管擴(kuò)張充血、出血，黏膜下層內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，蒙脫石散+地塞米松組直腸組織結(jié)構(gòu)較模糊，正常腸腺減少，黏膜下層及肌層細(xì)胞壞死，血管充血擴(kuò)張，伴有輕度出血。托里消毒散低劑量組黏膜上皮缺失，固有層內(nèi)部分腸腺壞死，結(jié)構(gòu)模糊，間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管輕微充血。托里消毒散中劑量組直腸組織結(jié)構(gòu)較完整，黏膜表面被覆單層柱狀上皮，固有層內(nèi)腸腺結(jié)構(gòu)基本正常，排列較稀疏。托里消毒散高劑量組直腸組織結(jié)構(gòu)較完整，固有層內(nèi)大腸腺排列較為密集，杯狀細(xì)胞數(shù)量正常，間質(zhì)內(nèi)少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)其他明顯病理改變。染色結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠直腸組織HE染色 ×400A：空白組；B：模型組；C：蒙脫石散+地塞米松組；D：托里消毒散低劑量組；E：托里消毒散中劑量組；F：托里消毒散高劑量組

2.2.2大鼠直腸組織病理炎癥評(píng)分及直腸直徑變化 與空白組相比，模型組直腸炎癥評(píng)分、直腸直徑升高(P<0.01)；與模型組相比，托里消毒散中、高劑量組可降低直腸炎癥評(píng)分及直腸直徑(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 放射性直腸炎炎癥評(píng)分及直腸直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 大鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、EGF水平與空白組比較，模型組IFN-γ、TNF-α水平升高，IL-4、IL-10、EGF水平降低(P<0.01)；經(jīng)不同處理干預(yù)，與模型組比較，托里消毒散高劑量組大鼠血清EGF、IL-4、IL-10水平升高，托里消毒散高劑量組大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平降低(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 大鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、EGF水平

2.4 大鼠血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量與空白組比較，模型組大鼠血清IgA、IgM、IgG水平降低(P<0.01)；經(jīng)不同處理干預(yù)，與模型組比較，托里消毒散高劑量組大鼠血清IgA、IgM、IgG水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 大鼠血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量

2.5 大鼠直腸組織TLR4、Myd88、NF-κB p65、IκBα表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，模型組較空白組TLR4、Myd88、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)均升高(P<0.01)，經(jīng)不同處理組干預(yù)治療，托里消毒散中、高劑量組TLR4、Myd88、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)較模型組均降低(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠直腸組織TLR4、Myd88、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)1：空白組；2：模型組；3：蒙脫石散+地塞米松組；4：托里消毒散低劑量組；5：托里消毒散中劑量組；6：托里消毒散高劑量組；與空白組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.6 大鼠直腸組織TLR4、Myd88、NF-κB p65、IL-6、IL-10 mRNA表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，模型組較空白組TLR4、Myd88、NF-κB p65、IL-6 mRNA表達(dá)升高，IL-10 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)；經(jīng)不同處理組干預(yù)治療，僅托里消毒散高劑量組TLR4、Myd88、NF-κBp65、IL-6 mRNA表達(dá)較模型組均降低，IL-10 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)。見(jiàn)表5。

表5 大鼠直腸組織TLR4、Myd88、NF-κB p65、IL-6、IL-10 mRNA表達(dá)

3 討論

RIP極大地降低了接受前列腺癌、子宮頸癌、直腸癌或膀胱癌放射治療患者的生活質(zhì)量，目前的治療往往不能減輕與RIP相關(guān)的疼痛和不適。中藥副作用及刺激性較小，可集中治療放射損傷和炎癥后的RIP，保護(hù)胃腸道，將顯著提高患者的生活質(zhì)量[7]。

淋巴細(xì)胞是受照射組織在急性期和慢性期白細(xì)胞侵襲的常見(jiàn)成分。已有研究表明結(jié)腸中可見(jiàn)的活化T細(xì)胞的持續(xù)浸潤(rùn)與黏膜損傷相關(guān)，T細(xì)胞能夠分化為不同的效應(yīng)T細(xì)胞亞群(Th1/Th2/Th17和Treg)，Th1/Th2亞群的免疫失衡已被證明在許多炎癥性腸道疾病中起決定性作用，并可能參與放射性損傷的慢性化。然而，幾乎沒(méi)有可用于表征局部照射后T細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)[8]。已經(jīng)證明定位于結(jié)腸直腸的分次照射誘導(dǎo)Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。此外，在缺乏Th1的環(huán)境中進(jìn)行腸道照射會(huì)加速纖維化過(guò)程的發(fā)生[9]。同時(shí)，研究[10]顯示Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生的促炎因子IFN-γ能夠調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞表面受體功能，抑制Th2細(xì)胞的增殖，引起組織損傷；而Th2細(xì)胞主要分泌的抑炎因子IL-4和IL-10，可抑制Th1細(xì)胞的增殖，使炎癥局限化，因此，Th1/Th2的平衡是調(diào)控細(xì)胞免疫和體液免疫之間的平衡的關(guān)鍵。EGF可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及對(duì)表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞趨化作用，使其遷移到受損部位，在創(chuàng)面愈合過(guò)程中起著重要的作用。免疫球蛋白IgG、IgM在機(jī)體出現(xiàn)炎癥及損傷時(shí)是介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的主要因子，在機(jī)體抵抗疾病的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的功能，其含量的高低是衡量機(jī)體防御功能的重要指標(biāo)[11]。因此，IgA、IgM、IgG含量的檢測(cè)可以作為判斷病情的有力證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠TNF-α、IFN-γ、IgA、IgM、IgG含量增加，而IL-4、IL-10、EGF含量呈降低(P<0.01)；干預(yù)治療后，僅托里消毒散高劑量組TNF-α、IFN-γ、IgA、IgM、IgG含量降低，IL-4、IL-10、EGF含量增加(P<0.05)。表明托里消毒散高劑量可使Th1/Th2平衡向Th1方向移動(dòng)，并影響免疫球蛋白表達(dá)從而影響炎癥損傷。

TLR4/NF-κB信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。TLR4在天然免疫中識(shí)別病原微生物和控制獲得性免疫反應(yīng)中起著重要的作用，TLR4被激活后銜接蛋白MyD88進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，促使一些細(xì)胞因子產(chǎn)生，加重腸道炎癥[12]。研究[13]證實(shí)TLR4基因缺陷小鼠的結(jié)腸固有層中有少量的炎癥浸潤(rùn)，而未敲除TLR4基因的小鼠則有嚴(yán)重的腸道炎癥，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中的TLR4結(jié)構(gòu)域與MyD88羧基端結(jié)合引起MyD88大量募集下游蛋白后，NF-κB炎癥通路被激活，NF-κB的激活是腸道炎中炎癥反應(yīng)激活和增殖的關(guān)鍵步驟。此外，大量臨床研究也表明應(yīng)用 NF-κB p65寡核苷酸可明顯降低黏膜中NF-κB p65和細(xì)胞因子的表達(dá)，改善臨床癥狀的嚴(yán)重程度，因此，NF-κB在炎癥發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。激活NF-κB信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)大量的炎癥介質(zhì)如 TNF-α、IL-6等表達(dá)，而這些炎性介質(zhì)又進(jìn)一步活化 NF-κB，形成一個(gè)正反饋循環(huán)，使炎癥反應(yīng)不斷放大，加重腸道炎癥反應(yīng)和黏膜的損傷[14]。IL-6是由各種細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子并發(fā)揮多效性作用[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組較空白組有大量的TLR4、Myd88、NF-κB p65、IL-6表達(dá)，給予托里消毒散治療后，托里消毒散中、高劑量組TLR4、Myd88、NF-κB p65、IL-6表達(dá)降低(P<0.05)。表明托里消毒散可減輕局部炎癥反應(yīng)表現(xiàn)，通過(guò)抑制NF-κB的激活，進(jìn)一步降低炎性介質(zhì)IL-6的表達(dá)。

綜上，托里消毒散隨劑量增加可改善放射性直腸炎大鼠的直腸組織病理學(xué)改變，對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)均具有一定作用，表明托里消毒散對(duì)放射性直腸炎的作用機(jī)制可能與TLR4/NF-κB有關(guān)。