常規(guī)CRISPR/Cas9系統(tǒng)也能進(jìn)行堿基替換（2020.9.23 中國(guó)科學(xué)雜志社）

CRISPR/Cas9基因編輯工具自2012年問(wèn)世以來(lái)，在生物學(xué)領(lǐng)域引發(fā)了一場(chǎng)新的技術(shù)革命。利用預(yù)先設(shè)計(jì)的多個(gè)不同的導(dǎo)向RNA，Cas9能夠在基因組的多個(gè)不同位置處精準(zhǔn)且高效地產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂。在高等真核生物（植物、動(dòng)物等）細(xì)胞中，這些DNA雙鏈斷裂主要通過(guò)NHEJ（非同源末端連接）的方式修復(fù)，其結(jié)果多為小片段的插入和刪除（Indels）。如果這些小片段的插入和刪除發(fā)生在基因的編碼區(qū)，就會(huì)高效地產(chǎn)生移碼突變，大概率地導(dǎo)致基因功能的喪失，因此CRISPR/Cas9又被廣泛地稱(chēng)為“基因敲除”工具。

除了基因敲除，堿基替換（例如單氨基酸突變相關(guān)疾病或性狀）是基因編輯領(lǐng)域中另一重要的應(yīng)用領(lǐng)域。但是，長(zhǎng)期以來(lái)學(xué)界普遍認(rèn)為，僅僅依靠Cas9的DNA切割功能及細(xì)胞自發(fā)的NHEJ修復(fù)無(wú)法進(jìn)行堿基替換。

要實(shí)現(xiàn)堿基替換，目前有以下幾種技術(shù)路線(xiàn)。1）將含有突變的DNA模板整合在Cas9的切口處，2）單堿基編輯器，例如CBE（C到T的堿基替換）、ABE（A到G的堿基替換）等將脫氨酶與Cas9融合來(lái)實(shí)現(xiàn)堿基編輯，以及3）PE（prime?editing）工具，利用RNA作為反轉(zhuǎn)錄的模板，與融合在Cas9（H840A）上的反轉(zhuǎn)錄酶配合實(shí)現(xiàn)堿基替換。但是，這些工具還或多或少的存在著效率低、脫靶風(fēng)險(xiǎn)高等問(wèn)題。此外，在一些國(guó)家的監(jiān)管政策中，以上三種方法產(chǎn)生的堿基替換產(chǎn)品會(huì)被列入轉(zhuǎn)基因監(jiān)管，極大地限制了它的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用潛力。

2020年9月21日，Science?China?Life?Sciences在線(xiàn)發(fā)表了題為“Programmed?sequential?cutting?endows?Cas9?versatile?base?substitution?capability?in?plants”的文章，提出了一種只依靠普通Cas9進(jìn)行堿基替換的方法。這種新的堿基編輯方法被命名為Cas9-mediated?Sequential?Editing（CSE），中文名為”循環(huán)打靶堿基編輯方案“。

其原理如下：

在高等真核生物（植物、動(dòng)物等）細(xì)胞中，NHEJ的修復(fù)往往造成小片段的插入和刪除（Indels），并且，其中最常見(jiàn)的是+1/-1bp的類(lèi)型。作者根據(jù)這一現(xiàn)象提出，如果第一次修復(fù)成-1bp的類(lèi)型，針對(duì)這一修復(fù)成的新序列設(shè)計(jì)特異的sgRNA，引導(dǎo)Cas9對(duì)其進(jìn)行第二次切割，那么第二次的NHEJ修復(fù)就有可能插入一個(gè)不同的新堿基，這樣就實(shí)現(xiàn)了任意的堿基替換。令人意外的是，這種簡(jiǎn)單的堿基編輯策略目前未見(jiàn)任何相關(guān)報(bào)道。

作者在擬南芥ALS基因的S653及W574位點(diǎn)，水稻的ACCase基因的W2038位點(diǎn)利用CSE策略成功實(shí)現(xiàn)了G到T，A到G，甚至TG到AT的堿基替換，創(chuàng)制了新的抗除草劑突變。值得指出的是，CSE方案能夠很好地配合Cas9-NGG和Cas9-NG實(shí)現(xiàn)堿基替換，因此CSE方案有望兼容其他識(shí)別不同PAM的Cas9變體，從而在基因組任意位點(diǎn)上進(jìn)行堿基替換。此外，動(dòng)物和植物細(xì)胞對(duì)Cas9切割的NHEJ修復(fù)結(jié)果類(lèi)似，因此作者相信CSE方案也能夠在動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)堿基替換。

該研究結(jié)果有以下幾方面的重要意義：

很大程度上改變了“僅僅依靠Cas9的DNA切割功能及細(xì)胞自發(fā)的NHEJ途徑無(wú)法進(jìn)行堿基替換”的觀點(diǎn)。

在堿基替換型產(chǎn)品的推廣應(yīng)用方面，尤其是在以所用方法進(jìn)行監(jiān)管的國(guó)家和地區(qū)，CSE方法具有明顯優(yōu)勢(shì)。例如，澳大利亞最新的監(jiān)管政策中規(guī)定，只利用Cas9進(jìn)行編輯得到的植物及動(dòng)物產(chǎn)品為非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，而利用堿基編輯工具（如CBE，ABE和PE等）得到的產(chǎn)品按照轉(zhuǎn)基因監(jiān)管。

目前的堿基編輯工具（CBE，ABE，PE等）的底層專(zhuān)利，多為國(guó)外壟斷;CSE方案是完全不同的堿基替換策略，或可突破這些底層堿基編輯專(zhuān)利的限制。

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院姜臨建副教授和青島清原化合物有限公司李華榮博士為文章的共同通訊作者，植保學(xué)院在讀博士研究生陽(yáng)威，清原公司戚偉、李玉才為該文的共同第一作者。研究得到了國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)和國(guó)家自然科學(xué)基金的資助。