豆天蛾蛹蛋白水解液飲料的研制

趙國秀，楊鑫茹，孫廣仁，劉艷秋

（北華大學林學院，吉林吉林132013）

昆蟲作為自然界最龐大的群體，如黃粉蟲[1]、蠶蛹[2-4]、蚯蚓、竹蜂、螞蚱、蜂蛹等，因體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪及其他營養(yǎng)物質(zhì)逐漸走進人們的視野[5-6]，被越來越多的人接受。此外，飼養(yǎng)、收獲和加工昆蟲蛋白的消耗和對環(huán)境的影響也要遠遠小于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)來源[7]。

目前全球被發(fā)現(xiàn)的昆蟲品種已達1 000萬，已知可食用的昆蟲也已達3 650多種。對此，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織曾在2013年發(fā)表報告倡導將昆蟲作為未來主要的食品來源，這一倡導也使得全球昆蟲食品行業(yè)進入前所未有的發(fā)展黃金期。

豆天蛾（Clanis bilineata tsingtauiica Mell）又稱大豆天蛾或豆青蟲，不僅擁有高于雞蛋、牛奶、大豆的蛋白質(zhì)含量，還含有豐富的不飽和脂肪酸，其中以亞麻酸為主。幼蟲中海藻多糖的含量更是哺乳動物的10倍以上，還含有豐富的VE、VB1、VB2等多種維生素以及 K、Zn、P等礦質(zhì)元素，可以有效延緩衰老[8]、降低血脂、血壓、抗癌和提高智力等。檸檬（Citrus lemon L.）富含多種功效成分如檸檬酸[9]、類黃酮[10-12]、D-檸檬烯[13-16]，可以有效提高人體免疫力，預防癌癥、壞血癥、心臟病、中風、心血管硬化和口腔潰瘍[17-19]等多種慢性疾病。尤為重要的是，檸檬所提供的獨特芳香氣味可以很好的掩蓋豆天蛾食品帶來的蟲腥味。

本文正是基于檸檬對豆天蛾蛹氣味良好的遮蔽效果，通過單因素和正交試驗確定豆天蛾蛹最佳的酶解反應條件，再進行配方優(yōu)化，最終制得一款富含氨基酸的果汁飲料，為昆蟲食品行業(yè)的進一步發(fā)展提供了嶄新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干豆天蛾蛹、檸檬：市售；風味蛋白酶（10萬U/g）：浙江一諾生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

SOX406型脂肪測定儀：海能儀器股份有限公司；DHG-9245A型電熱鼓風干燥箱、HWS-12型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；TU-1810型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；ME204型電子天平：格特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-24 M型離心機：湖南湘鑫儀器儀表有限公司；PHS-3C型pH計：上海雷磁公司；JYL-CO2 OE型破壁機：九陽股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 指標檢測方法

1.3.2.1 理化指標

氨基酸態(tài)氮含量按照GB 5009.235-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》檢測；葡萄皮及VC的DPPH自由基清除率的測定參考郭文莉[16]的方法進行。

1.3.2.2 感官指標

設計豆天蛾蛹飲料的感官評定標準，確定其感官評價由色澤、香氣、滋味和組織狀態(tài)4個因素組成。選取30人小組進行評分，總分設定為100分，其中包括色澤30分、蟲味遮蔽效果40分、滋味15分以及組織狀態(tài)15分。評定標準見表1。

表1 豆天蛾蛹飲料感官評定標準Table 1 Sensory evaluation criteria for pupa beverage of Clanis bilineata tsingtauica Mell

1.3.3 豆天蛾蛹脫脂率的確定

以乙醚為溶劑，使豆天蛾蛹粉在40℃下索氏提取4 h，烘干后稱量粉重，確定豆天蛾蛹中脂肪含量。

1.3.4 豆天蛾蛹酶解條件的確定

1.3.4.1 豆天蛾蛹酶解條件的單因素試驗

分別研究豆天蛾蛹粉的加入量（0.01、0.05、0.09、0.13、0.17 g/mL），酶用量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%），酶解溫度（35、40、45、50、55 ℃），酶解 pH 值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），酶解時間（2、4、6、8、10 h）對豆天蛾蛹酶解效果的影響。

1.3.4.2 豆天蛾蛹酶解條件的正交試驗

在單因素結(jié)果的基礎上，分別以酶用量、酶解溫度、酶解pH值、酶解時間，進行正交試驗，以氨基酸態(tài)氮的含量為檢測指標，確定豆天蛾蛹最佳的水解反應條件。其因素水平表見表2。

1.3.5 水解液DPPH自由基清除率的測定

在最佳的水解反應條件下將干豆天蛾蛹粉進行水解，調(diào)配試劑。在25℃下避光反應30 min，并在517 nm處進行測定，做3組平行試驗，并計算清除率。

式中：Ai為1 mL水解液加入2 mL DPPH的吸光度；A0為2 mLDPPH加入1 mL50%乙醇的吸光度；A2為1 mL水解液加入2 mL50%乙醇的吸光度。

表2 豆天蛾蛹酶解條件正交試驗的影響因素及水平Table 2 Influencing factors and levels of orthogonal test on enzymatic hydrolysis conditions of Clanis bilineata tsingtauica Mell

1.3.6 豆天蛾蛹飲料最佳配方的確定

1.3.6.1 豆天蛾蛹飲料配方的單因素試驗

分別研究水解液與檸檬汁體積比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5），濃縮汁與水的體積比（4 ∶6，4 ∶7，4 ∶8，4 ∶9，4∶10），白砂糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%），黃原膠添加量（0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%），羧甲基纖維素鈉添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）對豆天蛾蛹飲料感官評分的影響。

1.3.6.2 豆天蛾蛹酶解條件的正交試驗

在單因素結(jié)果的基礎上，分別以濃縮汁與水的比例、白砂糖添加量、黃原膠添加量、羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na） 添加量，進行正交試驗，以感官評價為依據(jù)，確定豆天蛾蛹飲料的最佳配方，其因素水平表見表3。

表3 豆天蛾蛹飲料最佳配方正交試驗的影響因素及水平Table 3 Influencing factors and levels of orthogonal test for optimum formulation of pupa beverage of Clanis bilineata tsingtauica Mell

2 結(jié)果與分析

2.1 豆天蛾蛹的脫脂率測定結(jié)果

將豆天蛾蛹粉碎后，在40℃下進行索氏提取4 h，烘干后稱量粉重，計算得脫脂率約為21.58%。

2.2 豆天蛾蛹酶解條件的確定

2.2.1 豆天蛾蛹粉添加量的確定

不同豆天蛾蛹粉添加量對氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖1。

根據(jù)圖1的曲線可以看出，豆天蛾蛹粉的添加量從0.01 g/mL至0.13 g/mL時，隨著添加量增加，水解液中氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加。當豆天蛾蛹粉的添加量為0.13 g/mL時，氨基酸態(tài)氮含量為1.97 g/L。但豆天蛾蛹粉的添加量高于0.13 g/mL時，氨基酸態(tài)氮含量下降，可能底物過多使酶解反應不完全。

圖1 不同豆天蛾蛹粉添加量對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effect of different addition amounts of Clanis bilineata tsingtauica Mell powder on amino acid nitrogen content

2.2.2 酶用量的確定

不同酶用量對氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖2。

圖2 不同酶用量對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of different enzyme additions on amino ccid nitrogen content

如圖2所示，當酶用量在0.1%至0.5%，隨著酶用量增加，氨基酸態(tài)氮的含量不斷增高。當酶用量超過0.5%時，氨基酸態(tài)氮的含量開始下降。產(chǎn)生的原因可能是隨著酶用量的不斷增加，產(chǎn)物不斷增多，會抑制底物的反應。

2.2.3 酶解溫度的確定

不同酶解溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖3。

圖3 不同酶解溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on amino acid nitrogen content

如圖3所示，當酶解溫度在35℃至50℃，隨著酶解溫度的提高，氨基酸態(tài)氮含量增加，當酶解溫度為50℃時，氨基酸態(tài)氮含量可達到2.01 g/L，產(chǎn)生的原因為適當?shù)募訜釙沟鞍踪|(zhì)的酶作用位點暴露，方便與酶更加充分的結(jié)合，促使酶解反應完全；而當溫度高于50℃時，酶活性受到抑制，氨基酸態(tài)氮含量下降。

2.2.4 酶解pH值的確定

不同酶解pH值對氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖4。

圖4 不同酶解pH值對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effect of different enzymatic hydrolysis pH on amino acid nitrogen content

結(jié)果如圖4所示，當pH值為6.0時，氨基酸態(tài)氮含量為2.22 g/L，酶解反應條件受pH值影響明顯，當pH值大于6時酶反應能力減弱，氨基酸態(tài)氮生成量減少。

2.2.5 酶解時間的確定

不同酶解時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖5。

圖5 不同酶解時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.5 Effect of different enzymatic time on amino acid nitrogen content

如圖5所示，隨著酶解時間的延長，氨基酸態(tài)氮的含量不斷增加，8 h時氨基酸態(tài)氮生成量為2.63 g/L。超過8 h后，氨基酸態(tài)氮的含量開始下降。這是因為一方面新產(chǎn)生的產(chǎn)物對底物有抑制作用，另一方面底物在不斷減少，酶也會隨著酶解時間的延長漸漸變性失活。

2.2.6 豆天蛾蛹酶解條件的正交試驗

以各個單因素的最佳條件為中心，上下各選取兩個參數(shù)進行正交試驗。正交試驗結(jié)果如表4所示。

根據(jù)正交試驗結(jié)果可得出4個單因素對豆天蛾蛹酶解反應影響大小的順序為：C（酶解pH值）＞A（酶用量）＞B（酶解溫度）＞D（酶解時間），即得到的最佳酶解條件為A3B1C2D2。這與單因素試驗結(jié)果A2B2C2D2和正交試驗第7組A3B1C3D2稍有偏差，進行驗證試驗，再次測定氨基酸態(tài)氮的含量，結(jié)果見圖6。

表4 豆天蛾蛹酶解條件正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test table of enzymatic hydrolysis conditions of Clanis bilineata tsingtauica Mell

圖6 豆天蛾蛹酶解最佳條件的確定Fig.6 Determination of the optimum enzymatic hydrolysis conditions of Clanis bilineata tsingtauica Mell

經(jīng)驗證試驗可得，最佳的酶解反應條件為酶用量0.5%、酶解溫度50℃、酶解pH6.0、酶解時間8 h。

2.3 豆天蛾蛹飲料最佳配方的確定

2.3.1 水解液與檸檬汁體積比的確定

水解液與檸檬汁體積比對感官評分的影響見圖7。

結(jié)果如圖7所示，當水解液與檸檬汁的體積比超過1∶3時，感官評分變化不明顯。這是由于當水解液與檸檬汁的體積比為1∶3時，檸檬香氣就已經(jīng)可以完全掩蓋水解液蟲味，所以后續(xù)檸檬汁比例的增加不會對感官評分產(chǎn)生影響。因此，通過試驗可以得出檸檬香氣對蟲味具有遮蔽效應。

圖7 水解液與檸檬汁體積比對感官評分的影響Fig.7 Effect of volume ratio of hydrolysate and lemon juice on sensory score

2.3.2 濃縮汁與水體積比的確定

濃縮汁與水體積比對感官評分的影響見圖8。

圖8 濃縮汁與水體積比對感官評分的影響Fig.8 Effect of volume ratio of concentrated juice and water on sensory score

如圖8所示，當濃縮汁與水的體積比為4∶8時，感官評分最高。此時飲料濃稠適宜，無蟲味。而當濃縮汁與水的體積比超過4∶8時，味道變淡，品質(zhì)下降。

2.3.3 白砂糖添加量的確定

白砂糖添加量對感官評分的影響見圖9。

圖9 白砂糖添加量對感官評分的影響Fig.9 Effect of white sugar addition on sensory score

如圖9所示，當白砂糖添加量低于8%時，口感過酸，刺激腸胃，影響身體健康；當白砂糖添加量高于8%時，口感過甜，與現(xiàn)代人低糖的飲食習慣不符。當白砂糖添加量為8%時，感官評分最高。

2.3.4 黃原膠添加量的確定

黃原膠添加量對感官評分的影響見圖10。

圖10 黃原膠添加量對感官評分的影響Fig.10 Effect of xanthan gum addition on sensory score

如圖10所示，當黃原膠添加量為0.05%時，檸檬顆粒的懸浮效果最好，評分最高。這是因為當黃原膠添加量過低時，檸檬顆粒多數(shù)沉淀。而當黃原膠添加量高于0.05%時，黃原膠溶解緩慢，會在飲料表面形成白色絮狀飄浮，影響感官評定。

2.3.5 羧甲基纖維素鈉添加量的確定

羧甲基纖維素鈉添加量對感官評分的影響見圖11。

圖11 羧甲基纖維素鈉添加量對感官評分的影響Fig.11 Effects of sodium CMC-Na on sensory score

如圖11所示，當CMC-Na添加量為0.10%時，檸檬顆粒完全懸浮，口感最佳，感官評分最高。當CMCNa添加量超過0.10%時，檸檬顆粒懸浮效果無變化，但飲料流動性減弱。

2.3.6 豆天蛾蛹飲料最佳配方的正交試驗

以各個單因素的最佳條件為中心，上下各選取兩個參數(shù)進行正交試驗正交試驗結(jié)果如表5所示。

表5 豆天蛾蛹飲料最佳配方正交試驗結(jié)果表Table 5 Orthogonal test table for optimum formulation of pupa beverage of Clanis bilineata tsingtauica Mell

續(xù)表5 豆天蛾蛹飲料最佳配方正交試驗結(jié)果表Continue table 5 Orthogonal test table for optimum formulation of pupa beverage of Clanis bilineata tsingtauica Mell

根據(jù)正交試驗結(jié)果可得出4個單因素對豆天蛾蛹飲料最佳配方影響大小的順序為：F（白砂糖添加量）>G（黃原膠添加量）>E（濃縮汁與水體積比）>H（CMCNa添加量），即得到的最佳飲料配方為E2F2G2H3。這與試驗結(jié)果E1F2G2H2稍有偏差，進行驗證試驗。經(jīng)驗證試驗得出極差最優(yōu)組試驗所得飲料感官評價較好。

2.4 水解液DPPH自由基清除率的測定

在最佳酶解反應條件下處理豆天蛾蛹粉，得到水解液。再將水解液與葡萄皮、VC以及幾種常見蔬果的DPPH自由基清除率進行比較，結(jié)果見圖12。

圖12 水解液與幾種常見物質(zhì)DPPH自由基清除能力的比較Fig.12 Comparison of DPPH scavenging capacity between hydrolysate and several common substances

經(jīng)3次平行試驗可得，豆天蛾蛹水解液DPPH自由基清除率為84.99%。與VC的DPPH自由基清除能力進行方差分析（P=0.09>0.05），結(jié)果表明兩組數(shù)據(jù)無差異，說明豆天蛾蛹水解液與VC抗氧化能力相當；與葡萄皮色素的DPPH自由基清除能力進行方差分析（P=0.87>0.05），結(jié)果表明兩組數(shù)據(jù)無差異，說明豆天蛾蛹水解液與葡萄皮抗氧化能力相當；與蓮藕、番茄的 DPPH 清除能力[16，20]進行方差分析（P<0.05），結(jié)果表明兩組數(shù)據(jù)差異顯著，說明豆天蛾蛹水解液的抗氧化能力超過蓮藕和番茄。

分析結(jié)果表明，豆天蛾蛹水解液具有較強的抗氧化能力，所研發(fā)的豆天蛾蛹飲料也具有一定的抗氧化效果。

3 結(jié)論

通過試驗得出豆天蛾蛹脂肪含量為21.58%，豆天蛾蛹蛋白最佳水解條件為0.13 g/mL的豆天蛾蛹粉、0.5%的風味蛋白酶、在50℃、pH值為6.0的條件下反應8 h，水解液對DPPH自由基的清除率為84.99%；水解液與檸檬汁按1∶3體積比調(diào)配成濃縮汁，再將濃縮汁與水按4∶8體積比混合，加入8%的白砂糖、0.05%的黃原膠和0.15%的羧甲基纖維素鈉。通過最佳配方試驗的分值可以看出豆天蛾蛹水解液的氣味可以被掩蓋。而且豆天蛾蛹水解液的抗氧化能力較強，對豆天蛾蛹水解液的研究具有現(xiàn)實意義，可以繼續(xù)深入，開發(fā)出更多的豆天蛾蛹系列產(chǎn)品。