快速水蒸氣蒸餾-氣相色譜熱能分析儀法測定肉制品和水產(chǎn)制品中13種N-亞硝胺

馬興，肖亞兵，陳穎，周磊，趙友全

（1.天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測中心，天津300461；2.上海海關(guān)，上海200002；3.天津海關(guān)工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300461；4.天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津300072）

N-亞硝胺類化合物是由胺類前體物質(zhì)與亞硝酸鹽在一定條件下反應(yīng)生成[1-3]。N-亞硝胺化合物眾多，常見的種類有N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamin，NDMA）、N-二乙基亞硝胺（N-methyl-N-nitrosoethylamin，NDEA）、N- 二 丙 基 亞 硝 胺 （N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-二苯基亞硝胺 （N-methyl-N-phenylnitrous amide，NDPhA）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）和N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）等。N-亞硝胺是國際公認(rèn)的毒性較大的污染物，研究顯示N-亞硝胺化合物可導(dǎo)致某些癌癥發(fā)病率升高[4-5]，具有肝毒性[6-7]。對(duì)人類而言，吸煙是N-亞硝胺攝入的主要途徑；飲食和食品接觸材料中N-亞硝胺化合物遷移和溶出則是非吸煙人群的主要攝入途徑[8-9]。目前，我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》[10]規(guī)定肉制品和水產(chǎn)制品中NDMA的限量標(biāo)準(zhǔn)分別為3.0 μg/kg和4.0 μg/kg，尚未給出其它N-亞硝胺化合物的限量要求。

N-亞硝胺化合物的檢測方法眾多，主要包括氣相色譜-熱能分析儀法（gas chromatography-thermal analyzer，GC-TEA）[11-12]，氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[13-14]，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[15-16]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[17-18]，高效液相色譜-熒光檢測法（high performance liquid chromatography with fluorescence detection，HPLC-FD）[19]等。美國公職化學(xué)家協(xié)會(huì)（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）和國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on CancerI，IARC） 對(duì)各種方法綜合評(píng)價(jià)后認(rèn)為，食品中N-亞硝胺分析的最好方法是GC-TEA。在國家標(biāo)準(zhǔn)中，氣相色譜-熱能分析儀法（GC-TEA）也被列為亞硝胺檢測方法之一[20]。食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，N-亞硝胺化合物限量要求苛刻，樣品前處理是檢測中的關(guān)鍵和難點(diǎn)。國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)檢測方法多采用水蒸氣蒸餾提取，雖然具有適用性強(qiáng)和有效控制基質(zhì)效應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，但是傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾時(shí)間較長，穩(wěn)定性差，嚴(yán)重影響檢測效率。研究人員嘗試采用較為先進(jìn)的固相萃取[21]，分散液液微萃取[22]和快速樣品前處理技術(shù)（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe，QuEChERS）[23]等前處理方法作為改進(jìn)，但是NDMA檢出限難以滿足限量要求。

本研究使用課題組自主研發(fā)的快速水蒸氣蒸餾儀處理樣品，檢測過程中采用N-亞硝基二異丙胺（N-nitrodiisopropylamine，NDiPA）作為內(nèi)標(biāo)，GC-TEA 法檢測分析肉制品和水產(chǎn)制品中N-亞硝胺化合物?？焖偎魵庹麴s儀的使用，可以將水蒸氣蒸餾處理時(shí)間縮短至25 min，且水蒸氣蒸餾過程無需專人值守，達(dá)到設(shè)定蒸餾體積后自動(dòng)關(guān)停，節(jié)約了人力，提高了前處理效率。采用NDiPA作為內(nèi)標(biāo)，可有效修正濃縮過程中N-亞硝胺化合物的流失比例，提高了檢測的穩(wěn)定性，保證了良好的方法回收率。

1 材料與方法

1.1 儀器試劑

1.1.1 儀器

GC 200型氣相色譜儀、TEA 810型熱能分析儀：英國Ellutia公司；水蒸氣蒸餾儀：天津大學(xué)精儀學(xué)院與天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測中心合作研發(fā)；Value HL G3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph公司；ME2002E型電子天平（感量0.01 g）：瑞士梅特勒-托利多公司；CM-24-001型氮吹儀：北京成萌偉業(yè)公司；SIMF140LADL型制冰機(jī)：日本松下公司；DB-WAX型毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.50 μm）：美國安捷倫公司。

1.1.2 試劑

二氯甲烷（CH2Cl2）、氯化鈉（NaCl）、無水硫酸鈉（Na2SO4）、濃硫酸（H2SO4）、無水乙醇（C2H5OH）：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)品 [包含NDMA、NMEA、NDPA、N-亞硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亞硝基二異丁胺（N-diisobutylnitrosamine，NDiBA）、N-亞硝基二正丁胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基吡咯烷（NPYR）、N-亞硝基嗎啉（NMOR）、N-亞硝基-N-甲基苯胺（N-methyl-N-phenylnitrous amide，NMPhA）、N-亞硝基-N-乙基苯胺（N-ethyl-N-phenylnitrous amide，NEPhA）、N-亞硝基二異壬基胺（N-nitroso-N，N-di-（7-methyloctyl）amine，NDiNA）、N-亞硝基二芐胺 （N-nitrosodibenzylamine，NDBzA），1 000 mg/L，純度≥99.0%]、N-亞硝基二異丙胺（NDiPA，1 000 mg/L）：純度≥99.0%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

N-亞硝胺化合物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：移取200 μL亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至100 mL容量瓶中，用乙醇配制成濃度為2.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冷藏避光保存。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（N-亞硝基二異丙胺）：移取100μL亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至100mL容量瓶中，用乙醇配制成濃度為1.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冷藏避光保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液放至25℃，分別移取0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mL N-亞硝胺化合物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和1.0 mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，用乙醇配成濃度分別為 0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，其中內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為0.10 μg/mL，冷藏避光保存。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取勻質(zhì)待測樣品200.00 g（精確到0.01 g），置于1.0 L蒸餾管中，加入100 mL水和50 g氯化鈉，充分混勻并加入100 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后迅速連接至快速水蒸氣蒸餾儀。在500 mL平底燒瓶中加入100 mL二氯甲烷和少量冰塊，用以接收餾出液，冷凝管出口伸入吸收液液面以下。在快速水蒸氣蒸餾儀工作程序中設(shè)置餾出液收集量為300 mL，并啟動(dòng)程序。

蒸餾完成后，向平底燒瓶中加入20g氯化鈉和3mL的硫酸，攪拌使氯化鈉溶解，然后將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗進(jìn)行液液萃取，收集二氯甲烷層，并用150 mL二氯甲烷反萃水層3次，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉脫水。將二氯甲烷溶液置于蒸餾瓶，加入1.0 mL無水乙醇，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL～10 mL后，轉(zhuǎn)氮吹繼續(xù)濃縮至1 mL，搖勻后待測。

1.5 GC-TEA工作條件

色譜柱為DB-WAX，進(jìn)樣口溫度為250℃。程序升溫條件：初始溫度60℃，保持1 min，以15℃/min速度升溫到82℃，保持0 min，以1℃/min速度升溫到88℃，保持0 min，以15℃/min速度升溫到140℃，保持7 min，最后以20℃/min速度升溫到250℃，保持6 min。進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，流速為1 mL/min，載氣為氮?dú)猓ā?9.999%），進(jìn)樣體積為2 μL。熱能分析儀接口溫度設(shè)定為250℃，熱解室溫度設(shè)定為500℃。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為2次重復(fù)，結(jié)果以平均值表示。采用Microsoft Office Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水蒸氣蒸餾儀構(gòu)造及工作效果

項(xiàng)目組自主研發(fā)快速水蒸氣蒸餾儀結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 快速水蒸氣蒸餾的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure of rapid steam distillation

與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾儀相比，主要有以下改進(jìn)：①大反應(yīng)瓶容量，高水蒸氣產(chǎn)生量，蒸氣量可按需調(diào)節(jié)，至少能夠滿足200 g食品樣品的水蒸氣蒸餾前處理；②首次采用內(nèi)置冷凝循環(huán)機(jī)代替自來水冷凝，冷凝溫度可控范圍達(dá)-20℃～25℃，節(jié)水節(jié)能；③接液瓶內(nèi)置質(zhì)量傳感器、定時(shí)器，可通過該設(shè)計(jì)間接監(jiān)測體積蒸餾終點(diǎn)和時(shí)間蒸餾終點(diǎn)，而傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾多采用時(shí)間蒸餾終點(diǎn)，無法與國標(biāo)體積蒸餾終點(diǎn)要求相匹配；④采用珀?duì)柼禍丶夹g(shù)為接液瓶降溫，可保證接液瓶處于低溫狀態(tài)下，防止有機(jī)相揮發(fā)。同時(shí)采用本文所述快速水蒸氣蒸餾儀和傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾裝置處理魚干樣品，并用GB 5009.26-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中N-亞硝胺類化合物的測定》測定其中N-二甲基亞硝胺含量，結(jié)果如表1所示。

表1 不同水蒸氣蒸餾提取方法比較Table 1 Comparison of different steam distillation methods

通過表1可以看出，采用傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾裝置進(jìn)行樣品前處理平均蒸餾時(shí)間為85 min，而采用快速水蒸氣蒸餾儀平均蒸餾時(shí)間僅需15 min，工作效率提高了5倍；對(duì)同一樣品進(jìn)行6次重復(fù)檢測，與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾裝置相比，快速水蒸氣蒸餾儀進(jìn)行樣品前處理所得數(shù)據(jù)精密度有明顯改善。

2.2 色譜柱選擇

13種N-亞硝胺化合物分子量和極性差異較大。方法研究過程中考察了N-亞硝胺化合物在安捷倫DB-WAX毛細(xì)管色譜柱上的色譜行為，色譜柱規(guī)格均為 30 m×0.32 mm×0.50 μm。13種 N-亞硝胺和內(nèi)標(biāo)物的色譜圖見圖2。

圖2 13種N-亞硝胺和內(nèi)標(biāo)物的色譜圖Fig.2 Chromatogram of 13 N-nitrosamines and internal standard

從圖2可以看出，N-亞硝基甲基乙胺和N-亞硝基二乙胺，N-亞硝基二正丁胺、N-亞硝基哌啶和N-亞硝基吡咯烷等分子量相近的色譜峰均能夠完全分開，有效避免干擾。因此，后續(xù)試驗(yàn)采用DB-WAX毛細(xì)管色譜柱對(duì)N-亞硝胺類化合物進(jìn)行分離。

2.3 內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法效果比較

采用GB 5009.26-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中N-亞硝胺類化合物的測定》開展食品中N-亞硝胺類化合物的測定試驗(yàn)主要有兩個(gè)難點(diǎn)：一是傳統(tǒng)玻璃制水蒸氣蒸餾裝置操作繁瑣，穩(wěn)定性不好，導(dǎo)致精密度實(shí)驗(yàn)效果不佳；二是二氯甲烷萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮時(shí)溫度和壓力控制不好，使得N-亞硝胺化合物流失，導(dǎo)致回收率偏低。為有效改善回收率偏低的現(xiàn)象，本方法開發(fā)過程中，同時(shí)利用內(nèi)標(biāo)法（NDiPA）和外標(biāo)法進(jìn)行線性擬合，對(duì)空白樣品中13種N-亞硝胺化合物的回收率進(jìn)行了計(jì)算，如表2所示。

表2 內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法回收率和精密度結(jié)果比較（n=6）Table 2 Comparison of recovery and precision results between internal standard method and external standard method（n=6）

續(xù)表2 內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法回收率和精密度結(jié)果比較（n=6）Continue table 2 Comparison of recovery and precision results between internal standard method and external standard method（n=6）

結(jié)果顯示：外標(biāo)法定量的回收率為53%～85%，且集中在低回收率端；而內(nèi)標(biāo)法定量的回收率為82%～113%，精密度在2.57%～7.19%之間，說明內(nèi)標(biāo)法能夠更好地減少蒸餾、萃取、濃縮、氮吹等處理過程帶來的誤差，保證了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，有效提高了回收率，提高了結(jié)果的精密度。

2.4 方法線性關(guān)系、檢出限和定量限

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，對(duì) 0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測定。以13種N-亞硝胺化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為縱坐標(biāo)（y），以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），獲得線性相關(guān)方程。線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995，表明13種 N-亞硝胺化合物在 0.02 μg/mL～1.00 μg/mL 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。當(dāng)取樣量為200.00 g時(shí)，以信噪比（S/N）為3確定13種N-亞硝胺化合物的檢出限為0.05 μg/kg～0.18 μg/kg，以信噪比（S/N）為 10 確定13 種N-亞硝胺化合物的定量限為 0.17 μg/kg～0.59 μg/kg，具體結(jié)果見表3。

表3 13種N-亞硝胺化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 13 N-nitrosamines

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

選定不含目標(biāo)化合物的魚干、牛肉干、臘肉3種空白樣品，進(jìn)行3梯度6平行添加回收試驗(yàn)，用以考察本方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果列于表4。

表4 13種N-亞硝胺化合物的回收率和精密度（n=6）Table 4 Recovery and precision of 13 N-nitrosamines（n=6）

續(xù)表4 13種N-亞硝胺化合物的回收率和精密度（n=6）Continue table 4 Recovery and precision of 13 N-nitrosamines（n=6）

可以看出，13種N-亞硝胺化合物的平均加標(biāo)回收率范圍為80.1%～112.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.88%～7.16%（n=6），方法的準(zhǔn)確度和精密度符合實(shí)際檢測需求。

2.6 實(shí)際樣品測定

應(yīng)用本方法檢測了超市和電商渠道采集的魚干、臘肉、牛肉干、蝦皮4類共計(jì)16個(gè)商品，每類商品樣品量為4個(gè)。其中，有8個(gè)樣品檢出含有N-亞硝胺化合物，2個(gè)樣品NMDA含量超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)，分別是散裝即食魚片和散裝咸蝦皮，結(jié)果列于表5。

表5 實(shí)際樣品中13種N-亞硝胺化合物含量Table 5 Content of 13 N-nitrosamines in actual samples

續(xù)表5 實(shí)際樣品中13種N-亞硝胺化合物含量Continue table 5 Content of 13 N-nitrosamines in actual samples

結(jié)果顯示，4類樣品中均有NMDA檢出，其中魚干中檢出數(shù)值最高，蝦皮和臘肉次之，牛肉干中最低，其它種類N-亞硝胺化合物偶有檢出，含量較低。在魚片和蝦皮中，生魚片NMDA含量低于即食魚片，淡干蝦皮中NMDA含量低于咸蝦皮，說明腌制等加工過程促進(jìn)了NMDA的形成[24]。臘肉比牛肉干中NDMA含量高，可能與臘肉中脂肪含量較高[25]以及熏制加工方式有關(guān)[26]。

3 結(jié)論

本研究建立了快速水蒸氣蒸餾提取，結(jié)合氣相色譜-熱能分析儀檢測肉制品和水產(chǎn)制品中13種N-亞硝胺化合物的方法?？焖偎魵庹麴s提取過程僅需25 min，大大提高了檢測效率，提高了試驗(yàn)的穩(wěn)定性，改善了方法的精密度。終點(diǎn)自動(dòng)控制技術(shù)使蒸餾過程實(shí)現(xiàn)了無人值守操作，節(jié)約人力。內(nèi)標(biāo)法的采用減少了蒸餾、萃取、濃縮過程所帶來的誤差，提高了方法的回收率。本方法重現(xiàn)性好，定性定量準(zhǔn)確度高，測量下限滿足肉制品和水產(chǎn)制品中NDMA國家限量要求，是對(duì)國標(biāo)方法的有效改進(jìn)。