基于改進(jìn)移動窗口目標(biāo)轉(zhuǎn)化因子分析的多農(nóng)藥殘留自動化定性分析方法

楊清華，李尚科，劉霞，蔣立文，李跑，2，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長沙410125）

隨著人民生活水平的不斷提高，食品安全越來越受到關(guān)注，尤其是果蔬中多農(nóng)藥殘留問題是關(guān)注的焦點[1-2]。食品中多農(nóng)藥殘留的危害極大，輕則引起食物中毒，嚴(yán)重可導(dǎo)致癌癥、胎兒畸形等[3-5]。目前最常見的農(nóng)藥殘留檢測方法有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[6]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8]、液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）[9]等。色譜法靈敏度高，但易受基質(zhì)的影響；色譜聯(lián)用技術(shù)在質(zhì)譜的幫助下能使組分的定性更加快速和可靠，然而依舊較難實現(xiàn)對復(fù)雜基質(zhì)樣品中多農(nóng)藥殘留的快速自動化定性分析。此外，現(xiàn)如今大多數(shù)檢測方法僅僅是對樣品中已知存在的農(nóng)藥進(jìn)行檢測。Li等[10]建立一種蔬菜中三唑類殺菌劑（triazole fungicides，TFs）的磁固相萃取-氣相色譜-火焰離子化檢測器（magnetic solid phase extraction-gas chromatographyflame ionization detector，MSPE-GC-FID）檢測方法，該方法對5種TFs都有良好的線性范圍。然而此方法中磁性多孔有機(jī)聚合物的合成要經(jīng)過偶氮反應(yīng)，對萃取時間、pH值、離子強度、吸附劑用量、樣品體積和洗脫液進(jìn)行優(yōu)化后才能實現(xiàn)TFs的準(zhǔn)確分析，該方法步驟繁瑣，操作復(fù)雜，不適合多組分樣品的分析。張秀豐等[11]采用改進(jìn)快速樣品前處理技術(shù)為前處理方法，利用GCMS儀器實現(xiàn)對茶葉中毒死蜱、聯(lián)苯菊酯等農(nóng)藥殘留的檢測，結(jié)果在0.01 mg/L～3.00 mg/L顯示出良好的線性關(guān)系，此方法GC-MS檢測消耗時間長，也不適合多組分快速無損檢測。

由于食品中樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，在分析信號中易出現(xiàn)色譜峰重疊以及噪聲干擾等現(xiàn)象，導(dǎo)致樣品中農(nóng)藥殘留無法準(zhǔn)確檢測，而化學(xué)計量學(xué)對復(fù)雜信號中組分信號的提取以及背景噪聲的扣除都有著非常好的作用[12-16]?；瘜W(xué)計量學(xué)自動化解析可以縮短試驗時間、減少有毒有害試劑的使用，還可以對多種農(nóng)藥進(jìn)行同時檢測，從而實現(xiàn)樣品中農(nóng)藥殘留的快速定性分析。如今已發(fā)展了較多的化學(xué)計量學(xué)方法如化學(xué)因子分析的一系列算法[17]以及連續(xù)小波變換算法[18]等。Wu等[19]采用非負(fù)免疫算法（non-negative immune algorithm，NNIA）對韭菜的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，可以實現(xiàn)韭菜中撲草凈的快速檢測。NNIA算法適合對樣品中的特定組分解析[20]，但較難實現(xiàn)復(fù)雜體系中多農(nóng)藥殘留分析。本課題組[21]采用移動窗口目標(biāo)轉(zhuǎn)化因子分析算法（moving window target transfer factor analysis method，MWTTFA），9 min內(nèi)可得到36種農(nóng)藥殘留信息。然而MWTTFA對更為復(fù)雜的多組分樣品進(jìn)行解析時，往往出現(xiàn)誤判的情況，無法得到準(zhǔn)確的定性結(jié)果。為此，本文提出了改進(jìn)移動窗口目標(biāo)轉(zhuǎn)化因子算法（improved movingwindowtargettransferfactoranalysis，IMWTTFA），并對混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行自動化定性分析，并將標(biāo)準(zhǔn)洗脫和快速洗脫條件下的結(jié)果進(jìn)行比較與分析，以期實現(xiàn)對多農(nóng)藥組分的快速定性分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜儀：日本島津儀器公司。

氟樂靈、克百威、阿特拉津、西瑪津、六氯苯、抗蚜威、撲草凈、甲基對硫磷、甲拌磷、甲基毒死蜱、三唑酮、二氯丙酸、喹硫磷、腐霉利、殺撲磷、苯線磷、4，4-滴滴滴、β-硫丹、三氯殺螨醇、敵菌丹、甲氰菊酯、三氯殺螨砜、伏殺磷、雙甲脒、氯菊酯、氯菊酯反式、氯氰菊酯、甲胺磷、乙酰甲胺磷、仲丁威、殘殺威、氧化樂、2-氯氰菊酯、丁酰肼、α-硫丹、乙硫磷、氰戊菊酯、異丙威、喹硫磷：天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 色譜、質(zhì)譜條件

色譜質(zhì)譜條件參照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY 1380-2007《蔬菜、水果中51種農(nóng)藥多殘留的測定氣相色譜-質(zhì)譜法》[22]：GC-MS分析儀型號為QP2010 Ultra（日本島津），色譜柱CP-Sil8CB由美國VARIAN公司提供，規(guī)格為30 m×0.32 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口的溫度設(shè)置為250℃，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。標(biāo)準(zhǔn)洗脫程序升溫操作：95℃保持1.5 min，以20℃/min升溫至190℃，5℃/min升溫至230℃，25℃/min升溫至290℃保持20 min。快速洗脫程序升溫操作：以60℃保持2 min，以80℃/min升溫至260℃，保持6 min；載氣為He（純度≥99.999%），進(jìn)樣量為 2 μL，流速為 1.2 mL/min。電子轟擊源（EI）作為離子源，其溫度設(shè)置為230℃，傳輸線的溫度設(shè)置為280℃，電壓設(shè)置為70 eV。

1.3 試驗方法

本文在原有MWTTFA[21]的基礎(chǔ)上，根據(jù)檢測的實際條件對閾值進(jìn)行調(diào)整并增加對匹配區(qū)域內(nèi)保留時間譜峰的檢驗。IMWTTFA的計算有以下3個步驟：

1）收集常見240種農(nóng)藥的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，所有的質(zhì)譜圖均為標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)譜圖，創(chuàng)建240種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫。

2）以240種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜為輸入值，采用IMWTTFA對標(biāo)準(zhǔn)洗脫和快速洗脫條件下數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，由于在標(biāo)準(zhǔn)洗脫和快速洗脫試驗中得到的質(zhì)譜與質(zhì)譜庫中的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜存在一定的差異，匹配度的閾值降低為60%，篩選出高于閾值的結(jié)果，若在較短的洗脫時間內(nèi)存在明顯的高于閾值（60%）匹配區(qū)域，則初步判定該農(nóng)藥組分存在。

3）根據(jù)第二步篩選的結(jié)果與色譜（總離子色譜流圖）的保留時間進(jìn)行對比，如果色譜峰在此保留時間區(qū)域存在，則說明此農(nóng)藥組分存在。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)洗脫與快速洗脫條件色譜圖分析

按照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY1380-2007《蔬菜、水果中51種農(nóng)藥多殘留的測定氣相色譜-質(zhì)譜法》[22]的色譜條件對多農(nóng)藥殘留樣品進(jìn)行檢測。此外，為實現(xiàn)對農(nóng)藥殘留的快速檢測，采用縮減時間后的快速洗脫程序升溫對樣品進(jìn)行檢測。農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品的總離子色譜圖見圖1。

圖1色譜圖中（a）為標(biāo)準(zhǔn)洗脫條件的總離子流圖（35 min），（b）為快速洗脫條件總離子流圖（9 min）。數(shù)據(jù)點間隔均為0.47 s。圖1（a）中從5 min開始出峰，當(dāng)9 min時譜峰比較集中；圖1（b）中從4 min開始出峰，譜峰集中在4 min～7 min。從總離子流圖中可知，存在較多的譜峰重疊與背景干擾，因此較難實現(xiàn)樣品中多農(nóng)藥殘留的定性分析。

圖1 農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品的總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatography of standard pesticide mixtures

2.2 改進(jìn)移動目標(biāo)轉(zhuǎn)化因子解析結(jié)果分析

標(biāo)準(zhǔn)洗脫與快速洗脫程序解析結(jié)果對比見圖2～圖4。

以240種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜為輸入值，采用IMWTTFA對標(biāo)準(zhǔn)洗脫和快速洗脫條件下數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，經(jīng)過第二步篩選后得到了標(biāo)準(zhǔn)洗脫條件下為63種可能農(nóng)藥組分，快速洗脫條件下為47種可能農(nóng)藥組分。以甲拌磷結(jié)果為例，圖2（a）為標(biāo)準(zhǔn)洗脫條件下甲拌磷匹配度圖；圖2（b）為快速洗脫條件下甲拌磷匹配度圖。

圖2 甲拌磷匹配曲線圖Fig.2 Matching curves of phorate

從圖2（a）可知當(dāng)保留時間在9.076 min～9.262 min時，甲拌磷的匹配度超過60%且與總離子流圖中的保留時間進(jìn)行匹配存在色譜峰，初步判斷甲拌磷農(nóng)藥存在該樣品中。從圖2（b）可知當(dāng)保留時間在4.428 min～4.561 min時，甲拌磷的匹配度超過60%且與總離子流圖中的保留時間進(jìn)行匹配也存在色譜峰，初步判斷甲拌磷農(nóng)藥存在該樣品中。

圖3為標(biāo)準(zhǔn)洗脫條件下敵樂胺匹配度曲線圖。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)洗脫敵樂胺匹配度曲線圖Fig.3 The matching curve of standard elution dipyrolamine

由圖3可知，雖然整個洗脫時間內(nèi)存在高于60%的匹配區(qū)域，但是并未在較短的洗脫時間內(nèi)存在明顯高于閾值的匹配度區(qū)間。因此根據(jù)第二步篩選原則可判斷敵樂胺農(nóng)藥不存在該樣品中。

圖4為快速洗脫條件下β-硫丹匹配度曲線圖。

圖4 快速洗脫β-硫丹匹配度曲線圖與多農(nóng)藥殘留樣品的總離子流圖Fig.4 Matching curve of rapid elution of beta-endosulfan and total ion flow chromatogram of standard elution of multi-pesticides

從圖4可知，根據(jù)1.3中2）篩選原則保留時間在5.778 min～5.826 min時，此區(qū)域存在明顯高于閾值的匹配度；然而根據(jù)1.3中3）篩選原則將此區(qū)域與色譜圖總離子流的保留時間進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)色譜圖上并不存在譜峰，由此可判斷β-硫丹不存在該樣品中。

2.3 定性結(jié)果分析

本試驗將標(biāo)準(zhǔn)洗脫和快速洗脫條件下的結(jié)果進(jìn)行比較與分析，以期實現(xiàn)對多農(nóng)藥組分的快速定性分析。表1為多農(nóng)藥殘留樣品在標(biāo)準(zhǔn)洗脫條件下各組分的中英文、CAS號、保留時間和匹配度。經(jīng)IMWTTFA檢測到51種農(nóng)藥組分。

由表 1 可知，β-硫丹、α-硫丹、雙甲脒-2、氯菊酯-2、氯菊酯反式-2、氯氰菊酯-2、仲丁威-2、殘殺威-2、氰戊菊酯-2、異丙威-2、2-氯氰菊酯-2此11種農(nóng)藥僅存在于標(biāo)準(zhǔn)洗脫條件中。

表1 標(biāo)準(zhǔn)洗脫條件下各組分保留時間和匹配度數(shù)據(jù)表Table 1 Retention time and matching data of standard elution

續(xù)表1 標(biāo)準(zhǔn)洗脫條件下各組分保留時間和匹配度數(shù)據(jù)表Continue table 1 Retention time and matching data of standard elution

表2為多農(nóng)藥殘留樣品在快速洗脫條件下各組分詳細(xì)的保留時間和匹配度。經(jīng)IMWTTFA檢測到44種農(nóng)藥組分。

表2 快速洗脫條件下各組分保留時間和匹配度數(shù)據(jù)表Table 2 Retention time and matching data of rapid elution

由表2可知，三氯殺螨醇-2、敵菌丹-2、丁酰肼-2此3種農(nóng)藥僅存在于快速洗脫條件中。雙甲脒-2、氯菊酯-2、氯菊酯反式-2、氯氰菊酯-2、仲丁威-2、殘殺威-2、氰戊菊酯-2、異丙威-2、三氯殺螨醇-2、敵菌丹-2、丁酰肼-2、2-氯氰菊酯-2這12種農(nóng)藥與雙甲脒-1、氯菊酯-1、氯菊酯反式-1、氯氰菊酯-1、仲丁威-1、殘殺威-1、氰戊菊酯-1、異丙威-1、三氯殺螨醇-1、敵菌丹-1、丁酰肼-1、2-氯氰菊酯的質(zhì)譜相似，引起這種差異的結(jié)果可能是快速洗脫條件下的總離子流受樣品基質(zhì)影響嚴(yán)重，導(dǎo)致農(nóng)藥組分特別是同分異構(gòu)體組分的譜峰被掩蓋。

2.4 改進(jìn)移動目標(biāo)轉(zhuǎn)化因子分析與移動目標(biāo)窗口轉(zhuǎn)化因子分析方法結(jié)果的對比

按照已有文獻(xiàn)[23-24]將閾值調(diào)整為60%后，經(jīng)IMWTTFA進(jìn)行解析，標(biāo)準(zhǔn)洗脫條件第二步篩選農(nóng)藥為65種農(nóng)藥，快速洗脫條件第二步篩選農(nóng)藥為47種農(nóng)藥。標(biāo)準(zhǔn)洗脫條件下的敵樂胺、赤霉素、丁氟消等14種農(nóng)藥都不存在色譜峰，根據(jù)第三步篩選的原則，這14種農(nóng)藥都不存在該多農(nóng)藥殘留樣品中，所以標(biāo)準(zhǔn)洗脫條件下經(jīng)三步篩選為51種農(nóng)藥；快速洗脫條件下的β-硫丹、赤霉素、丁酰肼-1此3種農(nóng)藥都不存在色譜峰，根據(jù)第三步篩選的原則，這3種農(nóng)藥都不存在該多農(nóng)藥殘留樣品中，所以快速洗脫條件下經(jīng)三步篩選為44種農(nóng)藥。然而采用MWTTFA進(jìn)行自動化檢測時，設(shè)置的閾值為75%，且只經(jīng)過第一步和第二步的篩選，并沒有進(jìn)行第三步譜峰檢驗，所以檢測出的多農(nóng)藥殘留信息較少。所以本試驗利用IMWTTFA計算時，根據(jù)試驗條件對閾值進(jìn)行調(diào)整，使組分能夠被正確檢測到；此外IMWTTFA還對計算結(jié)果進(jìn)行了譜峰匹配，降低了試驗誤判的可能性。

3 結(jié)論

本文建立240種常見農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，確定IMWTTFA對GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行自動化解析的篩選步驟。IMWTTFA可以實現(xiàn)多農(nóng)藥殘留樣品中農(nóng)藥組分的定性分析，且結(jié)果表明快速洗脫條件得到的檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)洗脫條件得到的檢測結(jié)果基本一致，能夠為實際多農(nóng)藥殘留檢測提供一種有效方法。然而，IMWTTFA雖然能夠較大程度得到樣品中可能存在的所有農(nóng)藥的殘留信息，但遇到同分異構(gòu)體組分質(zhì)譜相近的情況時，較難得到所有組分信息，因此還需要對算法進(jìn)一步改進(jìn)。