糖酵解與線粒體功能障礙的關(guān)系及其在肝臟疾病中的潛在價值

顏耿杰， 林 鏞， 蘇會吉， 陳含笑， 班少群， 韋艾凌,， 毛德文， 龍富立

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院， 南寧 530200； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝病二區(qū)， 南寧 530023

肝臟是控制全身能量代謝的主要器官，包括葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代謝，在體內(nèi)營養(yǎng)平衡中承擔核心作用。葡萄糖和脂肪酸代謝主要發(fā)生在線粒體中。線粒體在肝細胞中數(shù)量非常龐大，占細胞體積的18%～20%，且更集中于三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)利用位點附近[1]，同時在能量代謝和細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮多種作用，包括細胞呼吸、氧化磷酸化、活性氧(reactive oxygen species，ROS)平衡和細胞死亡的調(diào)節(jié)等[2]。然而，在各種不利條件下，葡萄糖和脂質(zhì)代謝功能受到破壞，如糖酵解、糖異生、脂肪生成和脂肪酸氧化，這些代謝過程均在肝臟中進行。其中，糖酵解對肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的影響近年受到越來越多的研究關(guān)注。

1 糖酵解促進肝臟疾病進展

糖酵解是指葡萄糖被催化為丙酮酸，并提供2個還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和2個ATP的過程。丙酮酸可被丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)氧化為乙酰輔酶A，或者通過線粒體中的丙酮酸羧化酶轉(zhuǎn)化為草酰乙酸。在無氧條件下的丙酮酸通過乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)還原為乳酸鹽，或通過丙酮酸脫羧酶脫羧為乙醛。當肝臟處于病理狀態(tài)時，能量代謝將優(yōu)先從氧化磷酸化轉(zhuǎn)換為糖酵解，其結(jié)果是部分丙酮酸被轉(zhuǎn)換為乳酸鹽[3]。研究[4]表明，糖酵解過程改變的機制可促進非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)進展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，最終進展為肝硬化和肝細胞癌(HCC)的過程與氧化還原失衡和線粒體功能障礙相關(guān)。高脂飲食可抑制PDH的活性，并降低肝線粒體清除過氧化物的能力，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和NAFLD的進展。另有研究[5]發(fā)現(xiàn)，PDH激酶同工酶4(PDK4)可抑制NASH中PDH的活性，當PDK4在NASH小鼠肝臟中缺乏時，肝脂肪變性可顯著改善。綜上所述，PDH的抑制將破壞氧化還原平衡并促進肝臟疾病的進展，并且PDH的激活可改善氧化還原失衡和脂肪變性。此外，糖酵解活性的增強可促進線粒體ROS的產(chǎn)生，使對氧化還原失衡敏感的M2型丙酮酸激酶(recombinant pyruvate kinase isozymes M2，PKM2)轉(zhuǎn)移至細胞核中，從而促進IL-6和IL-1β的產(chǎn)生，進而引發(fā)炎癥[6]。反之，ROS又可抑制線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈酶，使甘油醛-3-磷酸脫氫酶和膜鈉通道失活，誘導(dǎo)肝細胞損傷，進一步加重脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細胞因子產(chǎn)生和脂質(zhì)積累，并促進肝臟炎癥和纖維化。而由異常糖酵解引起的線粒體功能障礙與ROS產(chǎn)生軸之間的惡性循環(huán)可促進肝細胞凋亡并向肝硬化和HCC進展[7-8]。上述發(fā)現(xiàn)均提示，糖酵解異?？纱龠M肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。

2 肝臟疾病增強糖酵解

糖酵解對肝臟疾病進展具有促進作用，而肝臟疾病中的病理狀態(tài)也影響糖酵解過程。由于代償線粒體中的ATP產(chǎn)生缺陷，糖酵解將隨著肝臟疾病嚴重程度加重而得到不同程度的增強。研究[9]發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者肝臟中的糖酵解酶，例如己糖激酶(hexokinase 2，HK2)、醛縮酶A和PKM2的基因表達較正常肝臟明顯上調(diào)，并且這些基因的表達與HCC的發(fā)生風險相關(guān)。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)HCC中存在有氧糖酵解，且HCC中癌細胞的有氧糖酵解程度得到增強，即使在有氧條件下也優(yōu)先將葡萄糖代謝成乳酸。上述發(fā)現(xiàn)均與氧化磷酸化到糖酵解代謝的轉(zhuǎn)變有關(guān)，氧化磷酸化作為主要的能量產(chǎn)生過程，當線粒體功能障礙時，為了解決氧化磷酸化受損導(dǎo)致的ATP生成失衡，糖酵解速率代償性升高，從而增強葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生。當葡萄糖水平升高時，相對較高的糖酵解速率能夠產(chǎn)生比氧化磷酸化更多的能量[11]。在大多數(shù)正常細胞中，線粒體氧化磷酸化和糖酵解產(chǎn)生的ATP分別約為90%和10%，而癌細胞依靠有氧糖酵解提供高達60%的ATP消耗[12]，并且癌細胞對ATP的需求越大，糖酵解產(chǎn)生的乳酸在細胞中積累得越多。研究[13-14]表明，癌細胞通過LDH-A增強糖酵解產(chǎn)生乳酸以防止其在缺氧環(huán)境中發(fā)生細胞凋亡，因此有部分學(xué)者認為，升高的乳酸有利于癌細胞逃避免疫，并為癌癥轉(zhuǎn)移提供酸性腫瘤微環(huán)境?？偠灾墙徒庠诓煌闻K疾病中的活性增強，并與線粒體功能障礙密切相關(guān)，這有助于彌補由氧化磷酸化受損而導(dǎo)致的能量缺陷，因此或可通過靶向調(diào)節(jié)有氧糖酵解中的關(guān)鍵因素，如抑制酶HK2、 PKM2或其他調(diào)節(jié)途徑，尋求肝臟疾病的潛在治療新方法。

3 糖酵解在肝臟疾病治療中的應(yīng)用前景

3.1 NAFLD 在NAFLD中，肝細胞的許多代謝途徑發(fā)生顯著變化，如糖酵解增強、乳酸生成、三羧酸循環(huán)、酮體生成減少、線粒體呼吸和ATP合成減少，這些代謝途徑之間存在著密切而復(fù)雜的相互作用。其中，糖酵解中的一些相關(guān)代謝途徑可能成為NAFLD潛在的治療靶點。最近的研究[15]發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可以通過LKB1-AMPK途徑下調(diào)香葉基香葉基二磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS)的表達來增強糖酵解，并導(dǎo)致小鼠原代肝細胞分泌的炎癥因子增加。此外，使用2-脫氧-D-葡萄糖抑制糖酵解可顯著緩解小鼠由于GGPPS缺失而導(dǎo)致的肝臟炎癥和纖維化。Kors等[16]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠肝臟富含亮氨酸重復(fù)序列的家族蛋白X1可以抑制糖酵解，并導(dǎo)致脂肪酸氧化增加和脂肪變性減少，或可作為NAFLD的新型治療靶點。Shannon等研究[17]發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠中PDH復(fù)合物的活性增強伴隨著PDK4活性降低和PDH磷酸酶同工酶2活性增強，而吡格列酮可使PDH復(fù)合物的活性正?；?，并抑制丙酮酸進入三羧酸循環(huán)中代謝。丙酮酸鹽的另一種代謝途徑是乳酸的產(chǎn)生，在生理條件下，乳酸主要作為心臟、骨骼肌和大腦的能量來源，而肝細胞可將過量的血漿乳酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖，然后帶回血漿。p300/CBP相關(guān)因子介導(dǎo)的 LDH-B 的高乙?；娇山档透渭毎x乳酸鹽的能力，并導(dǎo)致乳酸鹽積累，是NAFLD中乳酸鹽積累的主要原因之一，增加的乳酸不僅加重肝脂肪變性，還可以通過降低組蛋白去乙酰化酶的活性，增加組蛋白H3賴氨酸9的乙?；?，從而提高參與脂肪生成和脂肪酸攝取的基因表達[18]。

糖酵解活性的增強可促進線粒體ROS的產(chǎn)生，過量的ROS將攻擊細胞內(nèi)大分子化合物，如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等，并導(dǎo)致細胞死亡或誘導(dǎo)細胞凋亡，這也是NAFLD進展為NASH的重要因素之一。線粒體是細胞內(nèi)ROS的重要來源，線粒體ROS(mtROS)主要在線粒體內(nèi)膜中電子傳遞鏈的氧化磷酸化過程中產(chǎn)生，當mtROS增加時，由于線粒體功能障礙，諸如線粒體DNA(mtDNA)之類的線粒體損傷相關(guān)分子模式被釋放至細胞中或細胞外，mtROS被氧化以促進mtDNA的細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運，氧化后的mtDNA直接與含有核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域-、富含亮氨酸重復(fù)序列-和NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3結(jié)合，刺激IL-1β的產(chǎn)生，加速NAFLD進展[19]。因此，通過抑制mtROS，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，或可作為NAFLD的潛在治療手段。一項關(guān)于巨噬細胞和NASH的研究[20]發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A5通過直接靶向PKM2促進活性PKM2四聚體的形成，導(dǎo)致糖酵解抑制和線粒體氧化代謝激活，從而觸發(fā)巨噬細胞表型轉(zhuǎn)移和改善NASH，為NASH提供了一種新的治療方法。

3.2 肝纖維化 廣泛的慢性肝損傷，包括病毒性肝炎、膽汁淤積性肝病和NAFLD，可引起慢性肝臟炎癥并最終導(dǎo)致肝纖維化。如果能夠去除致病因子，肝纖維化是可逆的[21]。而當無法去除潛在病因時，早期識別、預(yù)防肝纖維化則成為臨床治療的關(guān)鍵。肝纖維化的特征在于肝星狀細胞(HSC)的激活、增殖和遷移?；罨腍SC進一步促進過量膠原蛋白的形成和細胞外基質(zhì)(ECM)的積累，導(dǎo)致持續(xù)性慢性肝損傷，若不及時加以干預(yù)，最終將進展為肝硬化和肝細胞癌。肝臟作為人體最大的代謝中心，探尋肝纖維化相關(guān)的代謝途徑改變可能有望發(fā)現(xiàn)肝纖維化的新標志物和治療靶點。研究[22]顯示，HSC在活化過程中存在有氧糖酵解，抑制有氧糖酵解中的LDH-A可阻斷HSC收縮。另有研究[23]發(fā)現(xiàn)，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose transporter，GLUT)1和PKM2在臨床患者和小鼠纖維化肝臟樣本中的表達均上調(diào)，且來自活化的 HSC外泌體中 GLUT1 和 PKM2表達顯著增加，表明HSC釋放的外泌體與HSC的活化和葡萄糖攝取相關(guān)，并通過運輸糖酵解相關(guān)蛋白進而影響肝臟非實質(zhì)細胞(包括靜止型HSC、Kupffer細胞和肝竇內(nèi)皮細胞)向糖酵解的代謝轉(zhuǎn)換。最近一項研究[24]發(fā)現(xiàn)，局灶性黏附激酶相關(guān)非激酶(FAK related non-kinase，F(xiàn)RNK)通過抑制有氧糖酵解，限制HSC的活化、增殖和遷移，并促進HSC凋亡，從而改善肝纖維化，表明FRNK可能是肝纖維化治療的潛在治療候選藥物。Rao等[25]利用特異性卵泡抑素樣蛋白1(follistatin like protein 1，F(xiàn)STL1)基因敲除小鼠構(gòu)建肝纖維化模型以探索巨噬細胞FSTL1在肝纖維化中的功能和機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)STL1促進了PKM2磷酸化和核易位，減少了PKM2泛素化以增強PKM2依賴的糖酵解，并增加了M1極化，在使用PKM2活化劑(DASA-58)后，F(xiàn)STL1介導(dǎo)的糖酵解和炎癥表現(xiàn)受到部分抑制。關(guān)于PKM2在肝纖維化中的作用已被證實，PKM2四聚化可逆轉(zhuǎn)肝纖維化，誘導(dǎo)PKM2四聚化以降低PKM2二聚體的水平可能是肝纖維化的潛在治療策略[26]。Zhou等[27]在肝纖維化小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)可通過激活Smad、p38絲裂原活化蛋白激酶和P13K/AKT信號通路，引起HSC中有氧糖酵解的增加，并誘導(dǎo)HSC中的GLUT1表達，促進肝纖維化的發(fā)展，而在肝纖維化的小鼠模型中使用GLUT1抑制劑后，肝臟炎癥和肝纖維化的程度明顯降低。Ban等[28]研究發(fā)現(xiàn)，木香烴內(nèi)酯可以抑制HK2的表達，進而抑制HSC活化，表明木香烴內(nèi)酯抑制糖酵解可能是治療肝纖維化的潛在策略。HSC激活是肝纖維化過程中的核心環(huán)節(jié)，有氧糖酵解是其代謝標志之一。因此，阻斷糖酵解或?qū)⒊蔀楦卫w維化的一種新型治療選擇。

3.3 肝細胞癌 早在1956年，德國生理學(xué)家奧托·海因里?！ね郀柋?Otto Heinrich Warburg)發(fā)現(xiàn)癌細胞更喜歡通過糖酵解消耗大量葡萄糖，而不是傾向于利用氧化磷酸化，即使在足夠氧氣的條件下也傾向于將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸鹽，這種現(xiàn)象被稱為有氧糖酵解或“Warburg效應(yīng)”。盡管在有氧糖酵解過程中ATP的產(chǎn)生效率較低，但在不同腫瘤中仍占ATP供應(yīng)量的50%～70%[29]。此外，在有氧糖酵解過程中產(chǎn)生的中間體可用于腫瘤生物大分子的生物合成，以滿足快速生長的需求，乳酸的產(chǎn)生也提供了一個酸性環(huán)境，以幫助癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[30]。HCC中有氧糖酵解的分子機制是一個復(fù)雜的過程，既包含細胞質(zhì)中糖酵解酶活性的改變，也包含細胞核中的遺傳變化，靶向抑制有氧糖酵解中關(guān)鍵酶的變化將在很大程度上影響HCC的進展。

HK是有氧糖酵解中的第一種限速酶，可催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)。HK有4種亞型，即HK1、HK2、HK3和HK4，但大多數(shù)正常組織僅表達HK1。然而，HK2在HCC組織中高度表達[31]，并且相對于其他亞型，HK2在促進有氧糖酵解方面更有效。首先，HK2與線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道蛋白1(voltage-dependentanionchannels，VDAC1)相互作用并結(jié)合，促進ATP合成相關(guān)酶的活化，以增強ATP的生成，并抑制細胞凋亡(圖1)。其次，當HK2與VDAC1結(jié)合時，其不會受到下游產(chǎn)物如G-6-P的抑制作用，從而增強糖酵解過程和提高ATP生成速率[32]。HK2的消耗可抑制糖酵解通量并誘導(dǎo)氧化磷酸化，增強HCC對藥物(如二甲雙胍)的敏感性，此外，HK2抑制劑還可協(xié)同增強HCC對索拉非尼的敏感性，從而抑制小鼠的腫瘤生長[31]。因此，基于HK在HCC中的關(guān)鍵作用，HK2或?qū)⒊蔀殚_發(fā)HCC新療法的靶點。

磷酸果糖激酶1(phosphofructokinase 1，PFK1)是參與糖酵解的第2種限速酶，可利用ATP催化果糖6-磷酸(F-6-P)轉(zhuǎn)化為果糖-1,6-二磷酸(FDP)。PFK1有3種亞型，分別為PFK-M、PFK-P和PFK-L，這些亞型的比例在不同組織中可能根據(jù)其特定的能量代謝需求而有所不同[33]。完全活化的PFK1以四聚體的形式存在，PFK1四聚體的形成和穩(wěn)定在很大程度上影響糖酵解通量速率。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-雙磷酸酶3(PFKFB3)分子是PFK1的變構(gòu)激活劑，可催化果糖-2,6-二磷酸(F-2,6-BP)的產(chǎn)生。PFKFB3在HCC糖酵解的調(diào)節(jié)以及腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，PFKFB3可易位至細胞核中，以調(diào)節(jié)細胞周期依賴性激酶(cyclindependent kinase，CDK)的活性，導(dǎo)致細胞周期阻滯并抑制細胞死亡[34](圖1)。研究[35]發(fā)現(xiàn)，在抑制PFKFB3的表達后聯(lián)合使用阿司匹林與索拉非尼，可通過誘導(dǎo)HCC細胞凋亡來克服索拉非尼的耐藥性，以增強HCC的治療效果。因此，在尋找化療藥物與糖酵解抑制劑的組合時，運用PFKFB3抑制劑可能成為克服索拉非尼耐藥性的有效手段。

糖酵解過程中的最后一種限速酶是丙酮酸激酶(PK)，其催化磷酸烯醇式丙酮酸產(chǎn)生ATP和丙酮酸。PK具有4種亞型，包括PKL、PKR、PKM1和PKM2，其中PKM2在癌細胞中高度上調(diào)，并且與預(yù)后不良有關(guān)[36]。PKM2有2種形式，一種是位于細胞質(zhì)中的四聚體，具有較高的催化活性，可以迅速將磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸、增加糖酵解通量和產(chǎn)生更多的ATP；另一種亞型是單體或二聚體，具有較低的催化活性，并且可以易位至細胞核中作為幾種轉(zhuǎn)錄因子[例如缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)、β-catenin/c-Myc、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)]的共激活劑[37](圖1)。一旦進入細胞核，PKM2可促進靶基因的轉(zhuǎn)錄，例如HIF-1α靶向表達GLUT、PKM2、LDH-A和血管內(nèi)皮生長因子A，從而促進癌細胞的生長，正反饋調(diào)節(jié)糖酵解和血管生成[38]。PKM2的表達水平與HCC的臨床病理特征有關(guān)，例如腫瘤的大小、數(shù)量和臨床分期，并且PKM2表達水平較高的HCC患者相較于PKM2水平較低的HCC患者表現(xiàn)出更高的復(fù)發(fā)率[39]。紫草素(shikonin)和原花青素B2可抑制PKM2的表達和有氧糖酵解的發(fā)生，從而抑制HCC的生長，表明PKM2有望成為治療HCC的又一治療靶點[40-41]。

注：HK2、PFK1和PKM2是糖酵解過程中的3種限速酶。HK2可催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖，并與線粒體外膜上的VDAC1相互作用和結(jié)合，從而促進ATP的產(chǎn)生和抑制細胞凋亡。PFK1可催化F-6-P為FDP，其活性受PFKFB3催化產(chǎn)物F-2,6-BP的調(diào)節(jié)。PKM2不僅能夠催化PEP合成丙酮酸，還能夠移位至細胞核內(nèi)，與一些轉(zhuǎn)錄因子如HIF-1α、β-catenin/c-Myc、NF-κB和STAT3共同激活，促進相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄。

4 小結(jié)與展望

糖酵解與線粒體功能障礙密切相關(guān)，由異常糖酵解引起的線粒體功能障礙與ROS產(chǎn)生軸之間的惡性循環(huán)促使肝病進一步惡化。在NAFLD肝細胞中，糖酵解顯著增強，導(dǎo)致血漿和肝臟中丙酮酸鹽的水平增加。丙酮酸也可以通過為三羧酸提供中間體轉(zhuǎn)化為草酰乙酸或乳酸，兩者在NAFLD中均增強。糖酵解活性的增強將促進線粒體ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致NAFLD進展為NASH，抑制mtROS維持線粒體穩(wěn)態(tài)或可作為NAFLD的潛在治療方案，阻止疾病進一步發(fā)展。越來越多的證據(jù)表明，HSC的活化過程中存在有氧糖酵解，在肝纖維化中，部分相關(guān)代謝途徑發(fā)生改變，因此通過一些代謝途徑阻斷糖酵解或?qū)⒊蔀楦卫w維化的一種新型治療選擇。有氧糖酵解在HCC的進展中發(fā)揮重要作用，包括增殖、免疫逃避、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成和耐藥性，通過靶向有氧糖酵解中包含的關(guān)鍵酶(例如HK2、PFK或PKM2)以及其他調(diào)節(jié)途徑對于突破當前HCC治療中的局限性可能具有重要意義。反觀肝衰竭，其核心機制為內(nèi)毒素、免疫反應(yīng)和炎癥級聯(lián)反應(yīng)等[42]，并且糖酵解參與其中[43]。筆者所在團隊前期研究[44]發(fā)現(xiàn)，解毒化瘀顆?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)急性肝衰竭大鼠肝線粒體PT孔開放，阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)換，抑制細胞色素C的釋放，影響caspase-3蛋白活性，從而抑制肝細胞凋亡。同時，還可能通過促進PI3K/AKT/mTOR信號通路表達進而有效改善肝細胞氧化應(yīng)激與線粒體受損[45]。在往后的研究中，可以嘗試以糖酵解與線粒體功能障礙之間的關(guān)系為落腳點，探索兩者在肝衰竭疾病進展過程中的代謝途徑變化，開展對肝衰竭進展的把控以及治療靶點的研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：顏耿杰負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；林鏞、蘇會吉、陳含笑、班少群參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；毛德文、韋艾凌、龍富立負責擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。