嗜冷黃桿菌及細(xì)菌性冷水病的研究進(jìn)展

柴靜茹，王荻，盧彤巖，曹永生，劉紅柏，李紹戊*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070； 2. 黑龍江省水生動物病害與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 哈爾濱 150070； 3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

嗜冷黃桿菌Flavobacteriumpsychrophilum是一種革蘭氏陰性菌，該菌主要感染鮭科魚類并引起細(xì)菌性冷水病(Bacterial cold water disease, BCWD)或虹鱒魚苗綜合征(Rainbow trout fry syndrome, RTFS)。自1948年從北美銀鮭Oncorhynchuskisutch體內(nèi)分離到嗜冷黃桿菌以來，研究者已在歐洲、南美、亞洲、澳大利亞等世界各地的集約化鮭鱒魚主養(yǎng)區(qū)分離到該菌，可見其流行和傳播范圍之廣[1]。嗜冷黃桿菌分致病性和非致病性菌株，主要感染鮭科魚類，也可感染非鮭科魚類[2]。病可導(dǎo)致鮭科幼魚高死亡率，并對全球鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。由于對嗜冷黃桿菌的流行規(guī)律和致病機(jī)制尚不清晰，嚴(yán)重制約了對BCWD防控技術(shù)的研發(fā)。目前，國外學(xué)者對嗜冷黃桿菌的研究已經(jīng)取得一些進(jìn)展，本研究中回顧和總結(jié)了對該菌的研究現(xiàn)狀，以期為國內(nèi)BCWD的防控提供科學(xué)參考。

1 嗜冷黃桿菌分類地位

1946年，Davis[3]首次觀察到從虹鱒尾柄部深度潰瘍處刮下的大量不運(yùn)動的細(xì)菌棒，命名為嗜冷嗜纖維菌Cytophagapsychrophila[4-5]。此后幾十年間，嗜冷黃桿菌的分類地位幾經(jīng)變化，1969年，Lewin[6]建議將其命名為橙屈橈桿菌Flexibacteraurantiacus；1989年，Bernardet等[7]認(rèn)為，該物種應(yīng)該重新分類并更名為嗜冷屈橈桿菌Flexibacterpsychrophilus；1996年，Bernardet 等[8]根據(jù)DNA-rRNA 原位雜交試驗(yàn)數(shù)據(jù)、脂肪酸甲基酯(fatty acid methyl ester，F(xiàn)AME)分析結(jié)果，將該菌歸至黃桿菌屬，正式命名為“嗜冷黃桿菌”。

2 嗜冷黃桿菌生物學(xué)性狀

2.1 形態(tài)特征

嗜冷黃桿菌是一種革蘭氏陰性、弱折射性、柔韌且具有圓形末端的細(xì)長桿狀細(xì)菌[9-10]，其會發(fā)生滑動運(yùn)動，但受營養(yǎng)物濃度的強(qiáng)烈影響[9,11]。此外，不同來源的分離株在運(yùn)動程度、培養(yǎng)時間、大小等特性上均有較大差異[12-13]。該菌在Cytophaga瓊脂上孵育2～3 d后呈淺黃色，直徑為2～3 mm，菌落形成一個特征性的煎蛋外觀，中心略微凸起，有輕微的蔓延，邊緣不規(guī)則[2]。顯微鏡觀察可見，該菌直徑0.7～1.5 μm，長度1.5～100 μm[9,11,14]。

2.2 培養(yǎng)特性

嗜冷黃桿菌在4～23 ℃下培養(yǎng)可以增殖，最佳培養(yǎng)溫度為15～18 ℃[10-11]。該菌耐受的高溫范圍為40～50 ℃，部分菌株在30 ℃下可存活超過60 min[15]。嗜冷黃桿菌可在濃度為0.5%～0.8%的NaCl中生長，細(xì)菌耐受鹽度為60～120，可存活15 min[9,15-16]。嗜冷黃桿菌通常在腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基等高營養(yǎng)濃度培養(yǎng)基中不生長或生長不良。嗜冷黃桿菌最初的選擇培養(yǎng)基為Cytophaga，配方是0.05%胰蛋白胨、0.05%酵母提取物、0.02%乙酸鈉、0.02%牛肉提取物(pH 7.0～7.2)[17]。使用最廣泛的培養(yǎng)基是TYES，配方是0.4%胰蛋白胨、0.04%酵母提取物、0.05%硫酸鎂、0.05%氯化鈣(pH 7.2)[18]。在培養(yǎng)基中添加胎牛血清或糖類，如半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和脫脂乳，均能促進(jìn)嗜冷黃桿菌的生長[19-20]。此外，在培養(yǎng)基中加入5 μg/mL妥布霉素可有效抑制環(huán)境病原菌的生長[21]。

目前，主要使用的培養(yǎng)基有胰蛋白酵母提取物培養(yǎng)基(Tryptone yeast extract salts,TYES)[15]、胰蛋白酵母提取物葡萄糖培養(yǎng)基(FLP)[22]和胰蛋白酵母提取物麥芽糖培養(yǎng)基(MAT)[23]。

2.3 生化特性

大多數(shù)嗜冷黃桿菌分離株可產(chǎn)生氧化酶和過氧化氫酶，水解明膠和酪蛋白，產(chǎn)生黃色色素(在10% KOH中從黃色變?yōu)槌壬?，降解酪氨酸，并裂解殺死大腸桿菌細(xì)胞[2]。所有嗜冷黃桿菌菌株均不能水解淀粉或利用多種碳水化合物，如七葉苷、果膠、幾丁質(zhì)、羧甲基纖維素等。此外，該菌不產(chǎn)生硫化氫、吲哚，不能分解纖維素，不能水解黃嘌呤[9,11]。

2.4 抗原特性

目前，科研人員利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)、高效液相色譜法(HPLC)、交叉免疫電泳(CIE )、雙向凝膠電泳(2D-PAGE)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、質(zhì)譜法(MS)、MALDI-TOF質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)等技術(shù)在嗜冷黃桿菌中鑒定到多種抗原，包括脂多糖LPS、糖蛋白P60、熱休克蛋白HSP60/HSP70等(表1)，有效提高了嗜冷黃桿菌的診斷和檢測效果，保護(hù)性抗原的篩選也為疫苗研制提供了重要依據(jù)。

表1 嗜冷黃桿菌中已鑒定的多種抗原Tab.1 Identified antigens in Flavobacterium psychrophilum

2.5 血清學(xué)特性

血清型鑒定具有高效省時、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，主要用于確定病原菌的血清型。嗜冷黃桿菌的抗原多樣性，使得研究者們提出不同的血清學(xué)研究方案。日本學(xué)者通過微量滴定凝集試驗(yàn)、載玻片凝集試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，分別在1994年提出O1和O2血清型，1999年增加O3血清型，2003年增加O4血清型[30]。Lorenzen等[31]1997年通過載玻片凝集試驗(yàn)得到FpT、Th(Th-1和Th-2亞型)和Fd共3種血清型。Mata等[32]2002年使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗夾心法確定了1～7共7種不同血清型。Rochat等[33]2017年報道了使用mPCR確定0～3共4種不同血清型。他們分別從不同的宿主魚種分離嗜冷黃桿菌觀察到血清型和宿主魚種間存在緊密聯(lián)系(表2)。嗜冷黃桿菌血清型的多樣性有利于未來疫苗開發(fā)時選擇合適疫苗菌株，同時也有利于國家或地區(qū)選擇性繁育鮭鱒魚品系以提高抗病性，有利于漁場或科研工作者進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測及對細(xì)菌性冷水病的控制。

表2 嗜冷黃桿菌血清分型系統(tǒng)及與宿主魚種的關(guān)系Tab.2 Serotyping systems of Flavobacterium psychrophilum and their association with host fish species

3 嗜冷黃桿菌致病性因子

3.1 黏附特性

黏附能力對于病原體成功定殖宿主組織十分重要。黏附分為特異性黏附和非特異性黏附。特異性黏附是通過細(xì)菌表面黏附素與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合；非特異性黏附取決于細(xì)菌表面上的某些結(jié)構(gòu)與支持基質(zhì)之間的疏水作用或離子相互作用。嗜冷黃桿菌可表達(dá)粗糙型和光滑型兩種不同的菌落表型，在體外光滑細(xì)胞比粗糙細(xì)胞更容易黏附于宿主表面[34]。嗜冷黃桿菌光滑細(xì)胞的黏附主要是由細(xì)胞間的相互作用介導(dǎo)。光滑細(xì)胞和粗糙細(xì)胞黏附能力的差異可能與嗜冷黃桿菌外膜上不同黏附素的表達(dá)或光滑細(xì)胞表面的疏水性有關(guān)[35]。黏附機(jī)制在細(xì)菌中具有多樣性，在致病性方面具有重要的意義。有報道稱，嗜冷黃桿菌對魚體表面、鰓和卵有較強(qiáng)的黏附性[36]。目前，在嗜冷黃桿菌中尚未觀察到與細(xì)菌黏附和定植有關(guān)的菌毛和鞭毛[31]。

3.2 外毒素

嗜冷黃桿菌的外毒素包括溶血素和胞外蛋白酶。細(xì)菌溶血素是一種細(xì)胞溶解性毒素，是重要的致病因子。在另一種魚類病原體鰻弧菌中，毒素VAH5能夠裂解虹鱒的紅細(xì)胞，VAH5的突變體毒力減弱[37]，在嗜冷黃桿菌中，由基因FP0063編碼的蛋白與VAH5有53%的相似度，該蛋白可能具有類似的致病作用，并與分泌的蛋白酶協(xié)同破壞組織[38]。虹鱒魚苗感染嗜冷黃桿菌后貧血明顯，推測其可能是由細(xì)菌溶解紅細(xì)胞和紅細(xì)胞自凝集導(dǎo)致[39]。部分溶解小牛紅細(xì)胞和虹鱒紅細(xì)胞的嗜冷黃桿菌，在添加小?；螋~血細(xì)胞的培養(yǎng)基上生長更好[31]。

胞外蛋白酶是嗜冷黃桿菌重要的毒力因子，可導(dǎo)致組織大量快速損傷。Otis[40]發(fā)現(xiàn)，從嗜冷黃桿菌液體培養(yǎng)基中粗提的胞外制劑對虹鱒具有致病性，且其病變發(fā)展方式與嗜冷黃桿菌感染相似。彈性蛋白酶是一種能夠破壞細(xì)胞外基質(zhì)蛋白組織的細(xì)胞外酶，通常被認(rèn)為是病原體的重要毒力因子。嗜冷黃桿菌中降解彈性蛋白的菌株比不降解彈性蛋白的菌株毒力更強(qiáng)，說明彈性蛋白酶可促進(jìn)對宿主的侵襲[41]。嗜冷黃桿菌還能憑借胞外蛋白酶裂解其他微生物，如嗜冷黃桿菌NCIMB 1947T能裂解大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌和假單胞菌[31]，這也為胞外蛋白酶屬于外毒素提供了證據(jù)。

3.3 脂多糖

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌中最具抗炎性的化合物之一，通常由3個區(qū)域組成：脂質(zhì)A的疏水區(qū)、非重復(fù)的“核心”寡糖和遠(yuǎn)端多糖即O抗原[42]。嗜冷黃桿菌的LPS由低分子量低聚糖和高分子量O抗原聚合組成，進(jìn)一步分析嗜冷黃桿菌CSF259-93的O型多糖結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它是一種由三糖重復(fù)單元組成的直鏈聚合物[43]。目前尚不清楚LPS如何協(xié)同其他毒力因子發(fā)揮作用。

3.4 分泌系統(tǒng)

細(xì)菌分泌系統(tǒng)負(fù)責(zé)將毒素轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)菌表面，對于細(xì)菌毒力具有重要作用。嗜冷黃桿菌基因組中已鑒定出ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、Sec依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和Sec獨(dú)立(TAT)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[38]。該菌無革蘭氏陰性菌中常見的Ⅲ型和Ⅳ型分泌系統(tǒng)，但編碼PorT和PorR蛋白[38]。在牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌中，PorT蛋白將毒力因子如蛋白酶和黏附素從外周胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，這對毒力產(chǎn)生至關(guān)重要[44]。PorR蛋白參與細(xì)胞表面多糖的生物合成，可能是毒力因子的靶蛋白[45]。因此，PorT和PorR蛋白產(chǎn)生的作用可能同樣適用于嗜冷黃桿菌。

4 細(xì)菌性冷水病流行病學(xué)特征

4.1 地理分布及宿主范圍

嗜冷黃桿菌地理分布廣泛，水生動物宿主種類繁多。最初嗜冷黃桿菌的地理分布被認(rèn)為僅限于北美[46]，如今嗜冷黃桿菌感染呈世界性分布，在全球多個國家和地區(qū)均分離到該菌，包括丹麥、法國、德國、挪威、西班牙、瑞典、英國、澳大利亞、加拿大、智利、日本、韓國和土耳其等[2]。嗜冷黃桿菌可感染所有鮭科魚類，如虹鱒、銀鮭、大西洋鮭Salmosalar、王鮭Oncorhynchustshawytscha、山鱒Oncorhynchusclarkii、北極紅點(diǎn)鮭Salvelinusalpinus、溪鱒Salvelinusfontinalis等，其中，虹鱒和銀鮭對嗜冷黃桿菌尤其易感。此外，嗜冷黃桿菌也可感染非鮭科魚類并形成疾病，如鯉Cyprinuscarpio、鯽Carassiuscarassius、丁鱥Tincatinca、香魚Plecoglossusaltivelis、鰻Anguillaanguilla和蝦虎魚Chaenogobiusurotaenia等均可成為嗜冷黃桿菌的感染宿主[2]。研究表明，做標(biāo)記的感染(供體)虹鱒和未感染(受體)虹鱒共處一缸，第7天受體虹鱒死亡，證實(shí)嗜冷黃桿菌在虹鱒中能水平傳播[47]。在成熟雌性虹鱒排卵前5～9 d腹腔注射嗜冷黃桿菌，發(fā)現(xiàn)卵巢液中嗜冷黃桿菌感染嚴(yán)重，證明嗜冷黃桿菌能垂直傳播[48]。嗜冷黃桿菌的水平和垂直傳播能力加劇了細(xì)菌性冷水病的流行發(fā)生。

4.2 臨床癥狀與組織病理學(xué)

患有BCWD的病魚早期表現(xiàn)為精神萎靡、食欲不振，鰭尖開始腐爛，可見嗜冷黃桿菌在鰭上附著形成白色區(qū)域，嚴(yán)重時可使鰭條分離[2]。其他病征還包括眼球突出、鰓蒼白、腹脹和腹水等。在BCWD的晚期病例中，患病魚尾柄部病灶處肌肉糜爛壞死，嚴(yán)重時尾椎骨外露，在背鰭、鼻顎處及背鰭和頭后部間的肌肉組織上可觀察到明顯病變。組織病理學(xué)觀察顯示，宿主組織廣泛出現(xiàn)病變，包括脾、肝和腎的局灶性壞死；空泡變性增多；腎嗜酸性粒細(xì)胞增多，含鐵血黃素增多；皮膚真皮和皮下外側(cè)肌肉組織出現(xiàn)細(xì)胞固縮、壞死和淋巴細(xì)胞浸潤等。患有慢性BCWD的病魚表現(xiàn)出螺旋式或不穩(wěn)定的游泳行為，尾部變黑和脊柱畸形。組織學(xué)檢查顯示，在脊柱和顱骨交界處發(fā)生骨膜炎、骨炎、腦膜炎和椎骨骨膜增生[49-50]。

虹鱒魚苗綜合征是由嗜冷黃桿菌引起的另一種疾病表現(xiàn)[51]，影響虹鱒的早期生活階段或囊苗到早期投喂發(fā)育階段。這種急性病可能導(dǎo)致魚苗50%或更高的死亡率，菌血癥與組織病理變化出現(xiàn)同步，包括貧血、白腎和白肝。虹鱒魚苗綜合征的其他特征性病征有昏睡、雙側(cè)眼球突出、深色皮膚色素沉著和鰓蒼白。

4.3 嗜冷黃桿菌的檢測方法

通常用瓊脂平板培養(yǎng)法從環(huán)境樣品中分離嗜冷黃桿菌，此外，還有其他能提高速度、靈敏度和精確度的檢測和鑒定方法，如凝集試驗(yàn)、免疫熒光抗體技術(shù)(FAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增(LAMP)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和巢式PCR[52]等，各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表3。

表3 嗜冷黃桿菌的檢測方法及優(yōu)缺點(diǎn)Tab.3 Advantages and disadvantages of the detection methods for Flavobacterium psychrophilum

5 細(xì)菌性冷水病的預(yù)防與控制

5.1 預(yù)防

疫苗是預(yù)防BCWD的重要和有效手段。迄今為止，已報道的BCWD疫苗包括亞單位疫苗、滅活疫苗、減毒疫苗，但大多疫苗均處于實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證水平，并未投入商業(yè)化市場。在過去幾十年中，人們多次嘗試開發(fā)用于預(yù)防BCWD的商業(yè)疫苗。有研究發(fā)現(xiàn)，利用特異性抗原制備的亞單位疫苗對魚類進(jìn)行免疫接種，如給虹鱒腹腔注射高濃度OmpH樣蛋白，無論是否存在弗氏完全佐劑，均可誘導(dǎo)魚類產(chǎn)生顯著的保護(hù)性免疫，存在和不存在弗氏完全佐劑的相對保護(hù)率分別為88.5%和54.1%。這種保護(hù)是對嗜冷黃桿菌OmpH樣蛋白產(chǎn)生較高滴度抗體的結(jié)果，該蛋白也具有抗菌活性[28]。細(xì)菌全細(xì)胞滅活疫苗由于其安全性和有效性，是最常用的誘導(dǎo)免疫的方法，在不引起細(xì)胞裂解的情況下獲得滅活細(xì)胞有不同的方法，如使用福爾馬林或熱失活。Fredriksen等[53]用福爾馬林滅活嗜冷黃桿菌后制成油包水型疫苗，使用高毒力嗜冷黃桿菌菌株滅活全菌疫苗肌肉注射，再用嗜冷黃桿菌感染魚，結(jié)果證明具有良好的保護(hù)作用。減毒疫苗是通過人工誘變獲得的弱毒株。lvarez 等[54]獲得了減毒的嗜冷黃桿菌突變體，其中ExbD2蛋白的基因編碼被破壞，該蛋白為TonB復(fù)合物的一部分，參與鐵攝取，給虹鱒肌肉注射該突變體，然后用毒性嗜冷黃桿菌進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明，虹鱒魚苗具有顯著的免疫保護(hù)性。LaFrentz等[55]發(fā)現(xiàn)了一種高度減毒的利福平抗性嗜冷黃桿菌菌株259-93B.17，經(jīng)過該菌株浸泡免疫的魚在免疫后10周產(chǎn)生了免疫保護(hù)性。此外，F(xiàn)d和Th血清型間的交叉保護(hù)已被證實(shí)，表明這兩種血清型可能共享一些主要抗原。

亞單位疫苗具有抗原組分單一、純度高、免疫反應(yīng)強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但其成本較高。滅活疫苗安全有效，但產(chǎn)生免疫保護(hù)所需時間長。減毒疫苗可長期刺激免疫系統(tǒng)，但有毒力復(fù)壯的風(fēng)險，且對貯存、運(yùn)輸要求條件較高，如需要冷鏈等。

5.2 控制

面對魚類傳染病，最好的管理策略就是將病原體引入或傳播的風(fēng)險降至最低，這樣才能明顯降低疾病暴發(fā)。保持優(yōu)良水質(zhì)，減少水體中有機(jī)物質(zhì)和亞硝酸鹽，降低飼養(yǎng)密度和消毒殺菌等措施，可以較好地預(yù)防疾病發(fā)生[56]。

使用抗生素是治療BCWD的首選方法，然而嗜冷黃桿菌對抗生素的耐藥性是一個嚴(yán)重的問題。如嗜冷黃桿菌智利分離株對阿莫西林、氟苯尼考敏感，而對惡喹酸、氟甲喹、恩諾沙星和土霉素等耐藥[57]；美國密歇根州五大湖分離株中24%的菌株對土霉素耐藥，所有分離株對氟苯尼考、惡喹酸、氟甲喹、恩諾沙星、紅霉素等敏感[58]；英國分離株對氟苯尼考、惡喹酸、土霉素、紅霉素敏感，而對氟甲喹、恩諾沙星耐藥[59]。目前美國FDA批準(zhǔn)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的抗生素有土霉素和氟苯尼考，而英國獸醫(yī)藥品管理局批準(zhǔn)氟苯尼考、土霉素和阿莫西林用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[58-59]。由于國內(nèi)無嗜冷黃桿菌分離鑒定的相關(guān)報道，其分離株的耐藥譜尚不清楚，對臨床抗菌藥物的選擇缺乏數(shù)據(jù)支撐，因此，在藥物使用上存在一定盲目性。

6 存在問題及展望

嗜冷黃桿菌是一種重要的魚類細(xì)菌性病原，由該菌感染引起的BCWD嚴(yán)重制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。雖然國外學(xué)者已進(jìn)行了諸多工作并取得了豐富的科學(xué)數(shù)據(jù)，但由于嗜冷黃桿菌不同分離株在基因型、血清型、致病性、耐藥性和宿主特異性上差異極大，且國內(nèi)未有相關(guān)系統(tǒng)報道，導(dǎo)致對中國嗜冷黃桿菌的流行情況、病原特性、致病機(jī)制和防控方法尚不清晰，無法制定有效的防控措施。鑒于此，國內(nèi)需加強(qiáng)以下幾方面的研究：

(1)系統(tǒng)開展國內(nèi)流行株的生物學(xué)特性、致病性、流行特性、耐藥性、宿主特異性等相關(guān)研究，建立病原菌庫及分子數(shù)據(jù)庫，補(bǔ)充基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

(2)重視和加強(qiáng)疫病檢驗(yàn)檢疫，建立檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，最大程度地減少或避免病原的水平及垂直傳播。

(3)為了更好防控該病，亟待開展嗜冷黃桿菌與宿主互作機(jī)制研究，并加快疫苗研發(fā)進(jìn)程，結(jié)合抗病選育等手段，實(shí)現(xiàn)BCWD的綜合防控，保障水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康可持續(xù)發(fā)展。