水產(chǎn)蛋白源生物活性肽研究進(jìn)展

林善婷，胡曉，李來(lái)好*，楊賢慶，吳燕燕，陳勝軍，趙永強(qiáng)，李春生，潘創(chuàng)

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214081)

中國(guó)水產(chǎn)資源豐富，水產(chǎn)品的生產(chǎn)量及消費(fèi)量均位于世界前列，然而中國(guó)水產(chǎn)品精深加工水平較低，大量的水產(chǎn)加工副產(chǎn)物(如頭、骨、皮、鱗、內(nèi)臟、碎肉等),以及低值魚、蝦、貝、藻等水產(chǎn)資源常被廢棄，不僅浪費(fèi)大量?jī)?yōu)質(zhì)蛋白資源，而且污染環(huán)境。生物活性肽是指蛋白原料經(jīng)酶解、分離、純化后制備出的具有特定生理功能的肽類物質(zhì)[1]。目前，越來(lái)越多的水產(chǎn)蛋白源生物活性肽被分離鑒定，如從海鞘Halocynthiaroretzi[2]、草魚Ctenopharyngodonidella[3]、鳳尾魚Coiliamystus[4]、微藻Chlorellavulgaris[5]、黑鯊魚Carcharhinusfalciformis皮[6]、牡蠣Saccostreacucullata[7-8]等蛋白水解物中分離出抗氧化肽，從大西洋鯖Scomberscombrus[9]、鳀Engraulisjaponicus[10]、海藻Saccharinalongicruris[11]、雪蟹Chionoecetesopilio[12]等蛋白水解物中分離出抗菌肽，從大西洋鮭Salmosalar明膠[13]、大馬哈魚Oncorhynchusketa皮[14]、比目魚Paralichthysolivaceus肌肉[15]等蛋白水解物中分離出降血壓肽，從菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum[16]、牡蠣Saccostreacucullata[17]、螺旋藻Spirulinaplatensis[18]等蛋白水解物中分離出抗癌/抗腫瘤肽。此外，以阿拉斯加鱈Eleginusgracilis骨骼[19]、波紋巴非蛤Paphiaundulata[20]、貽貝Mytiluscoruscus[21]等蛋白水解物制備的免疫調(diào)節(jié)肽，以及以鱈魚皮[22]、南極磷蝦Euphausiasuperba[23]、牡蠣[24]、鳀Engraulisjaponicus[25]、羅非魚皮[26]等蛋白水解物制備礦物質(zhì)離子結(jié)合活性肽等。以水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物及低值的魚、蝦、貝、藻等為蛋白原料制備水產(chǎn)蛋白源生物活性肽，既可減少環(huán)境污染，提高水產(chǎn)品高值化利用率，還可提高水產(chǎn)加工企業(yè)利潤(rùn)率和水產(chǎn)資源的綜合利用率，具有重大社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。本研究中，通過(guò)對(duì)水產(chǎn)蛋白源生物活性肽的酶解制備、純化鑒定、功能分類、結(jié)構(gòu)特征及作用機(jī)制等進(jìn)行綜述，以期為水產(chǎn)蛋白源生物活性肽的理論研究和產(chǎn)業(yè)化高值利用提供科學(xué)參考。

1 水產(chǎn)蛋白源生物活性肽的制備、純化及鑒定

1.1 酶解法制備生物活性肽

目前，酶解法是較為常用且安全有效獲得生物活性肽的方法，酶解反應(yīng)過(guò)程易控，條件溫和，無(wú)有害物質(zhì)產(chǎn)生，能制備特定的易于分離的活性肽[27]。由于蛋白質(zhì)的水解程度會(huì)影響其所產(chǎn)生肽段的生物利用度和生物活性，因此，選擇最適的水解條件(如溫度、pH、酶制劑和酶與底物比例等)至關(guān)重要。目前，用于制備生物活性肽的蛋白酶主要有胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶(protamex)和風(fēng)味蛋白酶等。根據(jù)已有的研究發(fā)現(xiàn)，制備抗氧化肽時(shí)，大多利用胃蛋白酶進(jìn)行酶解；制備抗菌肽時(shí)，主要利用protamex酶；制備降血壓肽及抗腫瘤肽時(shí)，常用胃蛋白酶和胰蛋白酶；制備礦物質(zhì)結(jié)合肽時(shí)，常用胰蛋白酶(表1)。同一種原料，經(jīng)不同的蛋白酶酶解后，其酶解產(chǎn)物會(huì)表現(xiàn)出不同的活性，如Alemán等[28]分別利用7種蛋白酶水解魷魚明膠蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Alcalase酶(來(lái)源于地衣芽孢桿菌的堿性絲氨酸型內(nèi)切蛋白酶)水解產(chǎn)物是最有效的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑(IC50為0.34 mg/mL)；而Esperase酶(一種由芽孢桿菌Bacillussp.分泌的絲氨酸型堿性蛋白酶)水解產(chǎn)物對(duì)人乳腺癌(IC50為0.13 mg/mL)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤(IC50為0.10 mg/mL)的細(xì)胞毒性作用最強(qiáng)；胰蛋白酶、Savinase酶(賽威蛋白酶，一種由芽孢桿菌Bacillussp.分泌的絲氨酸型蛋白酶)、Esperase酶和Alcalase酶水解產(chǎn)物的自由基清除能力最高。此外，除了使用一種酶制備活性多肽外，兩個(gè)或多個(gè)酶組合也成為制備特定多肽的熱門方法。最常見的是模擬人體胃腸消化，先后利用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶促分解蛋白質(zhì)，從而獲得目的多肽。Wang等[18]先后利用3種胃腸道內(nèi)肽酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)對(duì)螺旋藻進(jìn)行水解，其水解產(chǎn)物對(duì)3種癌細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肝癌細(xì)胞HepG-2和人胃癌細(xì)胞SGC-7901)均表現(xiàn)出抗增殖活性。除此之外，Wang等[4]利用堿性蛋白酶(pH 8.0，55 ℃，2 h)與中性蛋白酶(pH 8.0，55 ℃，3 h)雙酶組合水解鳳尾魚魚粉，獲得抗氧化寡肽。

表1 水產(chǎn)蛋白源生物活性肽Tab.1 Bioactive peptides derived from fishery proteins

綜上所述，不同的蛋白酶具有不同的酶切位點(diǎn)，其剪切蛋白后可產(chǎn)生不同氨基酸序列的肽段，從而具有不同的生物活性。因此，可根據(jù)不同的原料、不同的制備目的，選擇其最適合的酶或酶組合來(lái)制備具有特定活性的目標(biāo)肽。

1.2 生物活性肽的純化及鑒定

蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酶解后獲得的酶解產(chǎn)物中包含許多不同分子量大小的肽段，經(jīng)過(guò)逐步的分離純化后可獲得生物活性較高的目標(biāo)肽段。通常使用超濾(ultrafiltration，UF)對(duì)酶解產(chǎn)物中不同分子量大小的組分進(jìn)行初步的分離，利用離子交換色譜(ion-exchange chromatography，IEC)或凝膠色譜(gel filtration chromatography，GFC)對(duì)超濾后顯示出最高活性的組分進(jìn)行二次分離，最后使用反相高效液相色譜(reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)對(duì)活性最高的組分進(jìn)行鑒定前的純化。此外，在制備礦物質(zhì)離子結(jié)合活性肽時(shí)還需經(jīng)過(guò)固定化金屬親和層析色譜(immobilized metal affinity chromatography，IMAC)，進(jìn)而獲得具有特定離子結(jié)合活性的肽段。純化出目標(biāo)肽段后需對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列的鑒定及肽鏈結(jié)構(gòu)的表征，以便于日后對(duì)其進(jìn)行化學(xué)合成以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)肽產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化。研究時(shí)通常利用質(zhì)譜法(mass Spectrometry，MS)對(duì)未知肽鏈進(jìn)行氨基酸序列的鑒定，利用核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、紫外光譜(ultraviolet-visible spectroscopy，UV-vis)、傅立葉紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)等對(duì)肽鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。在分離目標(biāo)活性多肽及鑒定肽鏈的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特征時(shí)，需將上述多個(gè)方法聯(lián)合使用。例如，有研究利用GFC、RP-HPLC和Q-TOF LC-MS/MS(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)分別從海鞘[2]、牡蠣[7]、鰩Rajaporosa軟骨[29]和草魚皮[3]蛋白水解物中分離鑒定出抗氧化肽。利用UF、IEC、GFC、RP-HPLC和Milligen 6600蛋白質(zhì)測(cè)序儀分別從菲律賓蛤仔[16]和貽貝[21]蛋白水解物中分離鑒定出抗癌肽和免疫調(diào)節(jié)肽。利用羥基磷灰石色譜(hydroxyapatite chromatography，HAC)、IMAC、GFC、RP-HPLC及LC-ESI-MS/MS(liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry，液相色譜電離串聯(lián)質(zhì)譜)分別從南極磷蝦[23]、牡蠣[24]、阿拉斯加鱈魚皮[30]、鳀肌肉[25]等蛋白水解物中分離鑒定出鈣、鋅、鐵結(jié)合活性肽。

2 水產(chǎn)蛋白源生物活性肽的功能分類

2.1 抗氧化肽

生物分子的氧化是一種自由基介導(dǎo)的氧化反應(yīng)，在需氧生物的氧代謝過(guò)程中不可避免地形成有害自由基，如超氧陰離子和羥基與身體中的其他基團(tuán)或物質(zhì)迅速反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞或組織損傷，進(jìn)而造成疾病發(fā)生[2]。目前，有許多研究表明，蛋白多肽是潛在且優(yōu)良的食品抗氧化添加劑。從海鞘(Leu-Glu-Trp，相對(duì)分子質(zhì)量為446.23；Met-Thr-Thr-Leu，相對(duì)分子質(zhì)量為464.18；Tyr-Tyr-Pro-Tyr-Gln-Leu，相對(duì)分子質(zhì)量為845.41)[2]、牡蠣(Pro-Val-Met-Gly-Asp，相對(duì)分子質(zhì)量為518；Gln-His-Gly-Val，相對(duì)分子質(zhì)量為440)[7]、鳳尾魚(Thr-Pro-Ser-Ala-Gly-Lys，相對(duì)分子質(zhì)量為559)[4]、草魚皮(Pro-Tyr-Ser-Phe-Lys，相對(duì)分子質(zhì)量為640.74；Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Leu，相對(duì)分子質(zhì)量為618.89；Val-Gly-Gly-Arg-Pro，相對(duì)分子質(zhì)量為484.56)[3]、微藻(Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe，相對(duì)分子質(zhì)量為1309)[5]、黑鯊魚皮(Pro-Gly-Gly-Thr-Met，相對(duì)分子質(zhì)量為461)[6]、中華圓田螺肉Cipangopaludinacahayensis(相對(duì)分子質(zhì)量<1000)[31]等蛋白水解物中鑒定出的抗氧化肽，其相對(duì)分子質(zhì)量主要在400～1500。從已鑒定出的抗氧化肽氨基酸序列中總結(jié)發(fā)現(xiàn)，肽鏈富含一個(gè)或多個(gè)Leu、Pro、Val、Gly等疏水性氨基酸及Met、Trp、Phe等芳香族氨基酸。其DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)清除IC50值為1.29～10.00 mmol/L，羥自由基清除IC50值為2.606～6.063 mmol/L，Trolox當(dāng)量等效IC50值為0.0077～0.9600 mmol/L，并具有Fe2+結(jié)合能力及亞油酸乳液體系模擬的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力。此外，用于測(cè)定抗氧化的指標(biāo)較多，來(lái)源不同的抗氧化肽對(duì)同一指標(biāo)的抗氧化能力不同，如Kim等[2]從海鞘蛋白水解物中鑒定出Leu-Glu-Trp、Met-Thr-Thr-Leu和Tyr-Tyr-Pro-Tyr-Gln-Leu 3種抗氧化肽，其中Leu-Glu-Trp對(duì)DPPH自由基的清除活性最高，Leu-Glu-Trp和Tyr-Tyr-Pro-Tyr-Gln-Leu對(duì)氧自由基清除能力高于谷胱甘肽。

因此，為了比較不同原料中抗氧化肽的總抗氧化能力，應(yīng)制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，以衡量不同原料抗氧化肽的抗氧化能力，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)抗氧化肽制劑提供依據(jù)。天然水產(chǎn)蛋白源抗氧化肽因其具有安全性和有效性，逐漸被視為人工合成抗氧化劑的替代品，可用于食品、制藥和化妝品等行業(yè)。

2.2 抗菌肽

抗菌肽是許多生物先天免疫系統(tǒng)的主要成分，在保護(hù)宿主物種免受微生物入侵方面起重要作用。目前，由于細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性越來(lái)越高，尋求新型廣譜性的抗菌物質(zhì)已成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，鳀(Gly-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Thr-Ala-Leu-Lys， 相對(duì)分子質(zhì)量為1104.66)[10]、大西洋鯖(Ser-Ile-Phe-Ile-Gln-Arg-Phe-Thr-Thr，相對(duì)分子質(zhì)量為1094.7；Arg-Lys-Ser-Gly-Asp-Pro-Leu-Gly-Arg，相對(duì)分子質(zhì)量為1042.5)；Ala-lys-Pro-Gly-Asp-Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Pro-Arg，相對(duì)分子質(zhì)量為1111.6；Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Lys，相對(duì)分子質(zhì)量為1102.5)[9]、雪蟹酶解物[12]、海藻酶解物[11]、草魚魚鱗酶解物[32]等水產(chǎn)蛋白抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、枯草桿菌Bacillussubtilis、肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae、大腸桿菌Escherichiacoli、李斯特菌Listeriainnocua、副溶血性弧菌Vibrioparahemolyticus表現(xiàn)出抑制生長(zhǎng)的作用。鳀抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抗菌能力最強(qiáng)，其最小抑菌濃度為16 μg/mL，對(duì)大腸桿菌和肺炎鏈球菌的最小抑菌濃度分別為32、64 μg/mL[10]。當(dāng)肽濃度為2×105μg/mL時(shí)，大西洋鯖抗菌肽對(duì)李斯特菌和大腸桿菌表現(xiàn)出完全抑制[9]。草魚魚鱗酶解物對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、黑曲霉、毛霉、根霉菌、酵母菌的最小抑菌濃度范圍為16～64 μg/mL，表現(xiàn)出了廣譜的抑菌活性[32]。

綜上所述，通過(guò)分析抗菌肽氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，肽鏈中主要由Gly、Pro、Ala、Ile等疏水性氨基酸及Thr、Lys等氨基酸組成，其相對(duì)分子質(zhì)量一般大于1000。由于水產(chǎn)蛋白源抗菌肽具有廣譜且有效的抗菌活性，有望成為治療耐藥性傳染病的優(yōu)良替代品。

2.3 降血壓肽

高血壓是世界范圍內(nèi)的流行病，影響著全球15%～20%的成年人。目前，治療高血壓相關(guān)疾病(如心力衰竭、中風(fēng)、心肌梗死、糖尿病、腎病等)最有效的治療方法是抑制腎素或血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)的活性。然而，目前治療高血壓的藥物(卡托普利、賴諾普利等)雖然在控制高血壓方面有效，但也會(huì)產(chǎn)生副作用[14]。天然來(lái)源的水產(chǎn)蛋白降血壓肽由于其安全有效的優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為治療高血壓研究中的熱點(diǎn)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，從大馬哈魚皮(Gly-Leu-Pro-Leu-Asn-Leu-Pro，相對(duì)分子質(zhì)量為770)[14]、大西洋鮭明膠(Gly-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Val；Gly-Pro-Val-Ala；Gly-Phe)[13]、比目魚肌肉(Met-Glu-Val-Phe-Val-Pro，相對(duì)分子質(zhì)量為721.2；Val-Ser-Gln-Leu-Thr-Arg，相對(duì)分子質(zhì)量為703.4)[15]、扇貝(Val-Trp，相對(duì)分子質(zhì)量為304.17)[33]、牡蠣酶解物(相對(duì)分子質(zhì)量<3000)[34]等蛋白水解產(chǎn)物中可分離出降血壓肽，其中源自大馬哈魚皮的降血壓肽對(duì)ACE的抑制活性最高，其IC50為18.7 μmol/L，顯著低于比目魚肌肉降血壓肽(IC50分別為79、105 μmol/L)、扇貝降血壓肽(IC50為86.9 μmol/L)及大西洋鮭明膠降血壓肽(IC50分別為673.16、445.61、178.14 μmol/L)。此外，Lineweaver-Burk圖表明，水產(chǎn)蛋白源降血壓肽可分別作為ACE的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠使用這些肽后，其心率、收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈血壓均顯著降低[13-15]。目前已商業(yè)化生產(chǎn)的狐鰹Sardaorientalis降血壓肽制劑(Leu-Lys-Pro-Asn-Met)，自發(fā)性高血壓大鼠口服5周后，血壓降低了(11.7±1.3)mmHg，且在臨床研究中似乎無(wú)任何副作用[35]。

根據(jù)上述降血壓肽的氨基酸序列總結(jié)得出，降血壓肽中富含Gly、Pro、Ala、Val等氨基酸，肽鏈相對(duì)分子質(zhì)量小于1000。許多研究證明，水產(chǎn)蛋白源降血壓肽具有顯著的腎素或ACE抑制活性，可單獨(dú)使用或作為藥物的輔助劑用于降低血壓和改善與藥物相關(guān)的副作用。

2.4 抗癌肽及免疫調(diào)節(jié)肽

細(xì)胞凋亡作為程序性細(xì)胞死亡的一種形式是響應(yīng)癌癥療法的主要機(jī)制之一，由于調(diào)節(jié)凋亡途徑和選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通常不會(huì)引起炎癥或免疫反應(yīng)，細(xì)胞凋亡成為癌癥治療的優(yōu)選方式[36]。研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)蛋白肽，如菲律賓蛤仔(Ala-Val-Leu-Val-Asp-Lys-Gln-Cys-Pro-Asp，相對(duì)分子質(zhì)量為1950)[16]、牡蠣(Leu-Ala-Asn-Ala-Lys，相對(duì)分子質(zhì)量為515.29)[17]、螺旋藻(His-Val-Leu-Ser-Arg-Ala-Pro-Arg，相對(duì)分子質(zhì)量為935.1)[18]、魷魚明膠Esperase酶解物(相對(duì)分子質(zhì)量為500～1400)[28]、金錢龜Cuoratrifasciata(Ser-Ser-Pro-Gly-Pro-Pro-Val-His，相對(duì)分子質(zhì)量為777.39)[37]等抗癌肽，對(duì)HepG-2(人肝癌細(xì)胞)、 MCF-7/MDA-MB-231(人乳腺癌細(xì)胞)、SGC-7901(人胃腺癌細(xì)胞)、A549(人肺癌細(xì)胞)、HT-29(人結(jié)腸癌細(xì)胞)、U87(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞)、PC-3(前列腺癌細(xì)胞)等癌細(xì)胞表現(xiàn)出有效的抗增殖效果，其IC50值為0.10～1.58 mg/mL。

免疫系統(tǒng)在預(yù)防和控制疾病方面至關(guān)重要，許多合成型藥物已被證明可用于調(diào)節(jié)人體免疫功能，然而，大多數(shù)通過(guò)微生物或化學(xué)方法合成的免疫調(diào)節(jié)藥物具有毒性或副作用，這限制了其在預(yù)防和治療慢性疾病中的用途[38]。源于波紋巴非蛤(Pro-His-Thr-Cys，相對(duì)分子質(zhì)量為457；Val-Gly-Try-Thr，相對(duì)分子質(zhì)量為439；Glu-Phe，相對(duì)分子質(zhì)量為295；Leu-Phe，相對(duì)分子質(zhì)量為279；Glu-Gly-Ala-Lys，相對(duì)分子質(zhì)量為404；Trp-Leu，相對(duì)分子質(zhì)量為318)[20]、阿拉斯加鱈(Asn-Gly-Met-Thr-Tyr，相對(duì)分子質(zhì)量為584；Asn-Gly-Leu-Ala-Pro，相對(duì)分子質(zhì)量為470；Trp-Thr，相對(duì)分子質(zhì)量為305；Pro-Thr-Gly-Ala-Asp-Tyr，相對(duì)分子質(zhì)量為622)[19, 39]、貽貝(Gly-Val-Ser-Leu-Leu-Gln-Gln-Phe-Phe-Leu)[21]、青蛤(Arg-Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Val-Glu-Gly-Arg-Tyr-Leu-Val，相對(duì)分子質(zhì)量為1750.81)[38]、鮭(Pro-Ala-Tyr，相對(duì)分子質(zhì)量為349.15)[40]的水產(chǎn)蛋白免疫調(diào)節(jié)肽，具有多個(gè)免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，通過(guò)刺激脾淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、環(huán)氧化酶COX-2、腫瘤壞死因子TNF-α)的表達(dá)，激活NF-κB(核因子κB)和MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。

綜上可知，抗癌肽主要由4～15個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為500～2000，且肽鏈中富含Leu、Pro、Ala、Lys、Arg等氨基酸。免疫調(diào)節(jié)肽中富含一個(gè)或多個(gè)Pro、Leu、Phe、Met等疏水性氨基酸，且大多數(shù)免疫調(diào)節(jié)肽的相對(duì)分子質(zhì)量小于1000。

2.5 礦物質(zhì)結(jié)合活性肽

礦物質(zhì)是構(gòu)成人體組織和維持正常生理功能所必需的7大營(yíng)養(yǎng)素之一，膳食礦物質(zhì)的缺乏會(huì)導(dǎo)致許多疾病。礦物質(zhì)結(jié)合活性肽是指具有結(jié)合礦物質(zhì)離子活性的肽類物質(zhì)，其與礦物質(zhì)離子結(jié)合后，可促進(jìn)或增強(qiáng)礦物質(zhì)離子在腸道中的生物利用度。從南極磷蝦[23]、太平洋鱈魚骨[41]的酶解產(chǎn)物中可分別純化鑒定出鈣離子結(jié)合活性肽Val-Leu-Gly-Tyr-Ile-Gln-Ile-Arg(相對(duì)分子質(zhì)量為960.58)、Lys-Gly-Asp-Pro-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-Lys(相對(duì)分子質(zhì)量為954.5)。從牡蠣[24]、阿拉斯加鱈魚皮[22]蛋白水解物中可分別純化鑒定出鋅離子結(jié)合活性肽His-Leu-Arg-Gln-Glu-Glu-Lys-Glu-Glu-Val-Thr-Val-Gly- Ser-Leu-Lys(相對(duì)分子質(zhì)量為1882.0)、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly(相對(duì)分子質(zhì)量為842)。從阿拉斯加鱈魚皮[30]、鳀魚肌肉[25]蛋白水解物中可分別純化鑒定出鐵離子結(jié)合活性肽Ser-Cys-His(相對(duì)分子質(zhì)量為305)、Glu-Leu-Glu-Gly-Glu-Val-Asp-Ala-Glu-Gln-Lys(相對(duì)分子質(zhì)量為7593.90)、Glu-Gln-Asp-Thr-Ser-Ala- His-Leu-Glu-Arg-Met-Lys(相對(duì)分子質(zhì)量為8105.95)。

Caco-2細(xì)胞試驗(yàn)表明，從阿拉斯加鱈魚皮[42]、鳀[43]、海參Stichopusjaponicus卵子[44]等水產(chǎn)蛋白中制備分離的礦物質(zhì)結(jié)合活性肽在Caco-2細(xì)胞模型中均顯示出可增加鈣、鋅、鐵等礦物離子的攝取，促進(jìn)礦物質(zhì)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而提高礦物質(zhì)離子的吸收率。此外，動(dòng)物試驗(yàn)表明，從羅非魚鱗片蛋白[45]中制備的鈣離子結(jié)合活性肽可顯著增加大鼠幼崽股骨中骨礦物質(zhì)的密度、股骨鈣含量及血清鈣值，增強(qiáng)小腸對(duì)鈣的吸收。鴨蛋蛋白肽-Fe2+結(jié)合物(DPs-Fe2+)[46]及三肽鐵(Arg-Glu-Glu-Fe2+)[47]均可使缺鐵性貧血大鼠的體質(zhì)量、器官系數(shù)和血液學(xué)參數(shù)恢復(fù)到正常水平(P<0.05)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞頂膜的Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(divalent metal transporter 1，DMT1)、細(xì)胞基底膜的鐵蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin 1，F(xiàn)PN1)及鐵離子調(diào)節(jié)蛋白(Hepcidin)表達(dá)，這表明DPs-Fe2+和Arg-Glu-Glu-Fe2+均可作為潛在的Fe2+補(bǔ)充劑。鱈骨骼蛋白肽-Fe2+結(jié)合物[48]可使缺鐵性貧血大鼠的體質(zhì)量、身高和血液參數(shù)恢復(fù)到正常水平，與FeSO4相比，鱈骨骼蛋白肽-Fe2+結(jié)合物顯著增加了缺鐵性貧血大鼠體質(zhì)量，并有效改善血紅蛋白、血清鐵離子和轉(zhuǎn)鐵蛋白水平，還可恢復(fù)鐵離子與轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合能力。

續(xù)表1 水產(chǎn)蛋白源生物活性肽Cont.Tab.1 Bioactive peptides derived from fishery proteins

分析鈣、鋅、鐵離子結(jié)合活性肽氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，其肽鏈中基本含有Gly、Pro、His等氨基酸，且低分子量(相對(duì)分子質(zhì)量<1000)和高分子量(相對(duì)分子質(zhì)量>1000)肽均可結(jié)合礦物質(zhì)離子。

3 生物活性肽的結(jié)構(gòu)特征

3.1 分子量

不同的原料根據(jù)不同的制備目的，會(huì)利用不同的酶進(jìn)行水解，由于水解度不同，會(huì)產(chǎn)生不同分子量大小的肽段。研究表明，大多數(shù)抗氧化肽含有2～20個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為400～1500。源自草魚皮蛋白水解物的3種抗氧化肽，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為640.74、618.89和484.56[3]。從鰩軟骨蛋白水解物中分離鑒定的3種抗氧化肽，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為726.90、578.58和583.69[29]。對(duì)海鞘[2]、牡蠣[7]、鳳尾魚魚粉[4]、草魚皮[3]、鰹Katsuwonuspelamis肌肉[51]、鰩軟骨[29]等蛋白水解物的抗氧化活性研究均表明，小分子量組分的抗氧化活性高于大分子量的組分，其原因可能是較小分子量的肽與自由基的反應(yīng)更充分更完全。與此相似，在抗癌活性中，小分子量的肽顯示出更高的抗癌活性，這是因?yàn)樾》肿恿康碾谋却蠓肿恿康碾木哂懈叩姆肿舆w移率和擴(kuò)散性，可改善與癌細(xì)胞的相互作用，增強(qiáng)抗癌能力[52]。而大多數(shù)鑒定出的抗菌肽，其相對(duì)分子質(zhì)量基本在1000以上。Beaulieu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大分子量的海藻水解產(chǎn)物(相對(duì)分子質(zhì)量>10 000)對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌活性。此外，在鰱蛋白水解物中，由其最大分子量的組分而制備的肽-鋅結(jié)合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有最高的抗菌活性[53]。在帶魚蛋白水解物中，由其分子量最大的多肽制備的肽-Fe2+復(fù)合物顯示出最高的抗菌活性[54]。在礦物質(zhì)結(jié)合活性肽中，小分子量(<1000)和大分子量(>1000)的肽均可結(jié)合礦物質(zhì)離子。從阿拉斯加鱈魚皮水解物中分離鑒定出的鐵離子結(jié)合活性肽，其相對(duì)分子質(zhì)量為345[30]，而從鳀魚肌肉蛋白水解物中分離鑒定出的鐵離子結(jié)合活性肽的相對(duì)分子質(zhì)量分別為7594、8106[25]。

綜上所述，不同原料、不同制備條件獲得的同一活性肽具有相似的分子量，且抗氧化肽、降血壓肽、抗癌肽和免疫調(diào)節(jié)肽的分子量一般較小，而抗菌肽主要是大分子量肽，在礦物質(zhì)結(jié)合活性肽中既有小分子量(<1000)肽，也有大分子量(>1000)肽。

3.2 氨基酸組成

多肽鏈由兩個(gè)及兩個(gè)以上的氨基酸組成，其生物活性與其氨基酸的組成及含量密切相關(guān)。氨基酸的組成是抗氧化活性的關(guān)鍵因子，研究表明，大多數(shù)抗氧化肽、降血壓肽、抗癌/抗腫瘤肽和免疫調(diào)節(jié)肽富含Pro、Trp、Phe、Leu、Gly、Val等疏水性氨基酸及Tyr、Phe、Trp等芳香族氨基酸；抗菌肽中富含疏水性氨基酸Gly、Ala、Pro及酸性氨基酸Glu；礦物質(zhì)結(jié)合肽中富含Gly、His、Glu、Ala、Pro等氨基酸。如從草魚皮蛋白酶解物中純化的抗氧化肽，Trp、Tyr和Phe對(duì)自由基清除有較大貢獻(xiàn)[3]，源自鳳尾魚魚粉[4]的抗氧化肽，其肽序列中的疏水性氨基酸殘基(如Pro、Leu、Ala、Gly)通過(guò)提供電子或供體電子來(lái)穩(wěn)定活性自由基。芳香族氨基酸殘基可作為氫供體，并抑制自由基介導(dǎo)的過(guò)氧化鏈反應(yīng)，含有更多苯丙氨酸的肽鏈顯示出較強(qiáng)的抗氧化活性[51]。肽的支鏈氨基酸(Val、Leu和Ile)和非極性脂肪族氨基酸(Leu和Ala)對(duì)肽的抗氧化活性也有較大貢獻(xiàn)[55]。酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基的電子致密芳環(huán)有助于與促氧化金屬離子的結(jié)合，增強(qiáng)抗氧化活性[56]。富含甘氨酸殘基的高疏水性肽可結(jié)合富含脂多糖的疏水性細(xì)菌膜，進(jìn)而具有更高的抗菌活性[57]。通過(guò)分析源自鰱抗菌肽的氨基酸組分后發(fā)現(xiàn)，含有更多酸性氨基酸(如Glu和Asp)的肽在其復(fù)合物中顯示出更多的鋅結(jié)合含量，且羧基(包括羰基)是肽鏈中鋅離子的主要結(jié)合位點(diǎn)[53]。此外，純化的具有最高抗菌活性的帶魚蛋白肽-Fe2+復(fù)合物富含Glu、Asp和Ala[54]。有研究報(bào)道，許多ACE抑制肽含有色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，這些氨基酸羧基末端含有芳香族或疏水性氨基酸，在ACE抑制活性中起重要作用[14]。與此相似，免疫調(diào)節(jié)肽中最常見殘基也是疏水性氨基酸(如Val、Leu、Pro、Phe等)，已有研究證明，疏水性氨基酸、谷氨酰胺、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的一個(gè)或多個(gè)殘基促進(jìn)肽的免疫調(diào)節(jié)活性[20]。Jacquot等[58]報(bào)道，帶有2～3個(gè)正電荷的較長(zhǎng)疏水性肽具有更強(qiáng)的刺激小鼠脾細(xì)胞增殖的潛力。免疫調(diào)節(jié)肽通過(guò)與靶細(xì)胞表面上的特異性受體結(jié)合調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[59]。此外，肽鏈中的幾種氨基酸殘基和基團(tuán)(如羧基，磺基-氫基，負(fù)電荷和離子鍵)在多肽鏈發(fā)揮其生物活性中起著重要作用。在礦物質(zhì)結(jié)合活性肽中，其結(jié)合能力與肽鏈中Asp和Glu的羧基及His咪唑的富氮基團(tuán)有關(guān)[60]。羅非魚蛋白的鈣結(jié)合活性肽Trp-Glu-Trp-Leu-His-Tyr-Trp中Glu的羧基和His的咪唑基團(tuán)決定鈣離子的結(jié)合[61]。研究發(fā)現(xiàn)：Leu-Ala-Asn中的Asn、肽亞氨基和羰基的羧酸酯基團(tuán)可以參與鋅的配位[62]；親水性肽的鋅螯合物似乎比疏水性質(zhì)的螯合物具有更高的抗細(xì)菌活性，且羧基(包括羰基)是合成肽中鋅離子的主要結(jié)合位點(diǎn)[53]；鐵離子結(jié)合的主要位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于羧酸鹽基團(tuán)，且在較小程度上對(duì)應(yīng)于肽鍵[63]；磺基-氫基參與肌肉蛋白肽結(jié)合鐵，肽中Cys殘基與鐵的結(jié)合也受到鄰近或相鄰殘基的影響，而組氨酰殘基有助于鐵結(jié)合，促進(jìn)肌肉組織的鐵吸收[64]。

4 生物活性肽的作用機(jī)制

不同的生物活性肽具有不同的分子量、氨基酸組成和空間結(jié)構(gòu)，并通過(guò)不同的分子作用機(jī)制發(fā)揮其生物活性。

抗氧化肽Phe-Pro-Leu-Pro-Ser-Phe中Leu殘基在自由基清除過(guò)程起著至關(guān)重要的作用，當(dāng)用Ala取代Leu時(shí)，該肽的自由基清除能力和細(xì)胞保護(hù)作用幾乎喪失，且該肽可以增加PI3K(胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶)、Akt(蛋白激酶B)、磷酸化Akt、mTOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)、磷酸化mTOR等蛋白表達(dá)水平，表明肽Phe-Pro-Leu-Pro-Ser-Phe通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑建立了保護(hù)氧化損傷和促進(jìn)細(xì)胞存活的潛在機(jī)制[65]。

從鲃蛋白水解物中分離出的抗菌肽在與細(xì)菌細(xì)胞膜作用過(guò)程中，通過(guò)增加膜的通透性，釋放細(xì)胞內(nèi)的K+，誘導(dǎo)膜損傷機(jī)制，進(jìn)而對(duì)李斯特菌顯示出顯著的抗菌活性[66]。章魚小肽(OSP)與Zn2+結(jié)合后形成的OSP-Zn結(jié)合物對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出顯著的抗菌能力，OSP-Zn通過(guò)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮抗菌作用[67]。

利用分子對(duì)接技術(shù)研究降血壓肽Leu-Pro-Glu-Ser- Val-His-Leu-Asp-Lys(LL-9)、Val-Leu-Ser-Thr-Ser-Phe-Pro-Pro-Lys(VL-9)對(duì)AEC抑制作用的分子機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肽氨基酸殘基通過(guò)與ACE氨基酸殘基間的氫鍵、疏水力、范德華力及靜電作用與ACE結(jié)合，VL-9通過(guò)結(jié)合ACE的S2(His513、His353、Glu281)和S′1(Glu162)活性位點(diǎn)，而LL-9通過(guò)結(jié)合AEC的S1(Thr345)和S2(Tyr520)、Lys511、Gln281活性位點(diǎn)，肽VL-9、LL-9通過(guò)與ACE活性位點(diǎn)的有效相互作用抑制其活性，進(jìn)而起到降血壓的作用[68]。

抗癌肽對(duì)癌細(xì)胞具有高選擇性而優(yōu)先結(jié)合到含有負(fù)電荷和高流動(dòng)性的細(xì)胞外膜，改變癌細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性，此外，還可通過(guò)線粒體途徑和死亡受體途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡，從而起到抗癌的作用[69]。

免疫調(diào)節(jié)肽中，富含酸性氨基酸且分子量較大的肽鏈可增加細(xì)胞免疫因子IFN-γ(γ-干擾素)的分泌，而小分子量肽通過(guò)刺激單核細(xì)胞分泌TNF-α進(jìn)而起到免疫調(diào)節(jié)的作用[59]。

礦物質(zhì)結(jié)合活性肽中，鐵離子結(jié)合活性肽結(jié)合鐵離子后可提高鐵離子在腸道中的溶解度，肽-鐵結(jié)合物通過(guò)肽轉(zhuǎn)運(yùn)途徑將鐵離子轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，或肽-鐵結(jié)合物中的鐵離子經(jīng)胞膜上的鐵離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而提高腸道鐵離子的吸收[43]。此外，乳清蛋白濃縮物-鐵(WPC-Fe)結(jié)合物可增加雄性貧血斷奶大鼠血清中的血紅蛋白、鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的水平，促進(jìn)鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)[70]。

綜上所述，不同功能活性的水產(chǎn)蛋白肽通過(guò)不同的作用機(jī)制發(fā)揮其獨(dú)特的生理活性。

5 存在問(wèn)題及展望

水產(chǎn)蛋白源生物活性肽在腸道消化期間保持可溶且呈電中性，轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)消耗能量少，轉(zhuǎn)運(yùn)速度快，載體不易飽和，生理功效明顯，安全性高，來(lái)源豐富(如可利用低值魚、蝦、貝、藻及其加工副產(chǎn)物等為原料)，且其在細(xì)胞模型或動(dòng)物模型中的各類生物活性已得到試驗(yàn)性證實(shí)，因此，具有作為人體膳食補(bǔ)充劑的強(qiáng)大潛力，在功能性食品成分和配料領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。如抗氧化肽可用于化妝品中，降血壓肽可用于替代具有副作用的降血壓藥物，抗癌/抗腫瘤肽可用于癌癥的預(yù)防與治療，促礦物質(zhì)吸收肽可作為礦物質(zhì)缺乏人群的膳食礦物質(zhì)補(bǔ)充劑等。目前，國(guó)外已經(jīng)有工業(yè)化生產(chǎn)并銷售的水產(chǎn)活性肽，如利用日本沙丁魚制備的降血壓活性肽飲料等。隨著研究的深入，以水產(chǎn)蛋白為原料制備生物活性肽將具有廣闊的應(yīng)用前景。

盡管以水產(chǎn)蛋白為原料制備功能性食品已有不少研究，但絕大多數(shù)研究?jī)H限于試驗(yàn)基礎(chǔ)上的成果，在這些功能性產(chǎn)品商品化生產(chǎn)前，還需對(duì)其生物利用度、與不同食品基質(zhì)的相容性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性和體內(nèi)效率等進(jìn)行更多研究，主要包括以下幾個(gè)方面。

(1) 對(duì)于抗氧化肽，目前大多只研究其對(duì)體外自由基的清除能力，以及亞油酸乳液體系模擬的脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制能力，而關(guān)于體內(nèi)抗氧化效果的研究報(bào)道相對(duì)較少，且抗氧化肽在人體內(nèi)的安全性評(píng)價(jià)亟須進(jìn)一步研究。

(2) 降血壓肽、抗腫瘤肽、免疫調(diào)節(jié)肽及礦物質(zhì)離子結(jié)合肽應(yīng)重點(diǎn)探究其在胃腸道消化過(guò)程中的耐消化性能力及相關(guān)的穩(wěn)態(tài)化保護(hù)技術(shù)，同時(shí)對(duì)肽進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞通路/途徑，以及肽在細(xì)胞中發(fā)揮生理作用的機(jī)制等方面開展研究。

(3) 探明目標(biāo)肽劑量與生理效應(yīng)間的關(guān)系，需開展更多相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)和代謝組學(xué)研究。

(4) 活性肽產(chǎn)品在商業(yè)化之前需評(píng)估肽產(chǎn)品的臨床安全性，研究不同加工條件及食品輔料對(duì)目標(biāo)肽結(jié)構(gòu)和功能的影響，從而保障其生物活性。