三七多糖含量測(cè)定方法比較

蔡群虎 劉石磊 袁敏惠 王芬 胡會(huì)澤 張芳盛 郭霞 劉曉麗 辛文鋒

摘要：目的?通過(guò)比較硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法在測(cè)定三七多糖時(shí)的優(yōu)劣性，建立更準(zhǔn)確的三七多糖含量測(cè)定檢測(cè)方法，為三七、三七剪口的多糖質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法?依次用80%乙醇和純水提取三七藥材，水提部分得到三七多糖，對(duì)所得多糖采用硫酸-苯酚法和硫酸-蒽酮法分別測(cè)量三七粗多糖的含量。結(jié)果?從精密度的角度來(lái)看，苯酚硫酸法較蒽酮硫酸法可靠（RSD=0.419<3.66）。從回收率的角度來(lái)看，使用苯酚硫酸法測(cè)定時(shí)，回收率更高（98.06>97.60）。結(jié)論?苯酚硫酸法為更準(zhǔn)確測(cè)定三七粗多糖含量的檢測(cè)方法，此外，苯酚硫酸法還具有操作更簡(jiǎn)便、安全、快捷等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：三七粗多糖;硫酸苯酚法;硫酸蒽酮法;含量測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)：R285?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：1007-2349（2020）08-0059-04

【Abstract】Objective： To establish a more accurate method for the determination and detection of notoginseng polysaccharide content by comparing the pros and cons of the sulfuric phenol method and the anthrone sulfate method in the determination of notoginseng polysaccharides and provide an evaluation basis for the quality of polysaccharides in notoginseng and notoginseng snip.?Methods： The medicinal materials of Panax notoginseng were extracted with 80% ethanol and pure water in sequence， and the polysaccharides of Panax notoginseng were obtained by water extraction.?The content of crude polysaccharides of Panax notoginseng was measured by the sulfuric acid-phenol method and the sulfuric acid-anthrone method.?Results： From a precision point of view， the phenol sulfuric acid method was more reliable than the anthrone sulfuric acid method （RSD=0.419<3.66）.?From the perspective of recovery rate， the recovery rate is higher when the phenol sulfuric acid method was used for determination （98.06>97.60）.?Conclusion： The phenol-sulfuric acid method is a more accurate method to determine the content of the crude polysaccharides of Panax notoginseng.?In addition， the phenol-sulfuric acid method is easier to operate， and safer and faster.

【Key words】crude polysaccharide of Panax notoginseng， phenol sulfate method， anthrone sulfate method， content determination

三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]，為五加科人參屬多年生草本植物，主要藥用部位為根部，產(chǎn)地主要為云南文山，廣西等地[1]。三七為我國(guó)的傳統(tǒng)名貴中藥材，主要用于治療外傷出血、咯血、吐血、便血、胸腹刺痛、跌打腫痛等[2]。三七皂苷為三七的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、提高免疫力、保護(hù)心血管、保肝保腎等藥理作用[3]。三七多糖是三七另一個(gè)活性成分，在藥材中含量為6%-10%左右[4]，無(wú)毒副作用[5]，藥理研究表明三七多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值。為此本文對(duì)三七中的多糖提取物進(jìn)行了含量測(cè)定，比較了硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法在測(cè)定三七多糖時(shí)的優(yōu)劣性，為建立更準(zhǔn)確的三七多糖含量測(cè)定方法和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考依據(jù)。

1?材料、儀器和試劑

1.1?材料與試劑?材料：三七剪口皂苷提取后藥渣干品所制得粗多糖（云科藥業(yè)和云南三七科技有限公司技術(shù)中心提供）;

試劑：無(wú)水乙醇、苯酚、濃硫酸、蒽酮（以上試劑均為分析純）;

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所用標(biāo)準(zhǔn)品：葡萄糖

1.2?儀器與設(shè)備?萬(wàn)能粉碎機(jī);電子天平（梅特勒）;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（矛華DHG-9420）;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋;型循環(huán)水真空泵;RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;超聲波清洗器;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日歷）;雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海馳唐實(shí)業(yè)有限公司）;離心機(jī)（上海恒平）;真空干燥箱（瑪瑞特）。

2?方法與結(jié)果

2.1?苯酚硫酸法測(cè)定三七多糖含量

2.1.1?對(duì)照品溶液的制備?精密稱(chēng)取0.0100 g單糖標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL燒杯中，用超純水溶解，定容至100 mL容量瓶中，得對(duì)照品溶液。

2.1.2?三七粗多糖制備?精密稱(chēng)取三七剪口粗粉10 g于500 mL圓底燒瓶中，加入80%的乙醇200 mL回流提取2 h，棄過(guò)濾液，藥渣再加入80%的乙醇200 mL回流提取1.5 h，棄過(guò)濾液，收集藥渣。將藥渣于60℃鼓風(fēng)干燥箱揮干乙醇，加入純水熱回流提取2次，每次加入純水200 mL，每次提取2 h，合并兩次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸真空濃縮到50 mL，攪拌加入400 mL無(wú)水乙醇醇沉8 h，過(guò)濾取沉淀，冷凍干燥得三七粗多糖。

2.1.3?三七粗多糖樣液的制備?精密稱(chēng)取0.3 g粉碎后的三七粗多糖樣品于250 mL三角瓶中，向三角瓶中加入220 mL蒸餾水，加蓋保鮮膜，80℃水浴回流加熱2h，然后進(jìn)行藥棉自然過(guò)濾，并將濾液轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中;將濾渣連同藥棉一同轉(zhuǎn)入燒杯中，加入20 mL蒸餾水，80℃水浴1 h，之后抽濾，合并兩次濾液，定容至250 mL容量瓶中。從容量瓶中取2 mL液體于燒杯中，加入無(wú)水乙醇10 mL使含醇量達(dá)到80%，冷藏1h，有沉淀析出，過(guò)濾收集沉淀，沉淀用水溶解25 mL定容，搖勻，即制得樣液。

2.1.4?3%苯酚溶液的配制?稱(chēng)取3.0 g重蒸苯酚，加入96 mL超純水，于棕色瓶中，置于冰箱保存。

2.1.5?供試液的配制?準(zhǔn)確吸取1 mL的“2.1.3”項(xiàng)下的多糖樣液，再加入“2.1.4”項(xiàng)下1 mL苯酚，4 mL濃硫酸，搖勻，反應(yīng)10 min后，用冰水浴迅速冷卻至室溫，即得供試液。

2.1.6?標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制?準(zhǔn)確吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，加水補(bǔ)足1 mL，按“2.1.5”項(xiàng)下方法操作，在490 nm處測(cè)定其吸收值，以吸光度A為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度ρ為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：A=13.333ρ-0.0229，R^2=0.9985，線(xiàn)性范圍為0.011～0.074 mg/mL。

2.1.7?精密度試驗(yàn)?精密吸取三七粗多糖樣液1 mL，按“2.1.5”項(xiàng)下方法操作，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，重復(fù)測(cè)定6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.419%，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.8?穩(wěn)定性試驗(yàn)?精密稱(chēng)取三七粗多糖0.3 g，按“2.1.3”、“2.1.5”項(xiàng)下方法制備供試液，分別在10、20、30、40、50、60 min測(cè)定吸光度。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.09%，表明加入苯酚、硫酸的供試溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1.9?回收率試驗(yàn)?精密吸取0.3 mL三七粗多糖樣液三份，分別加入0.1、0.2、0.3 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下方法操作，在490 nm處測(cè)定其吸光度，按公式計(jì)算加樣回收率，平均回收率98.06%，RSD=1.19%，所得結(jié)果見(jiàn)表3。

2.1.10?三七粗多糖的含量測(cè)定?精密吸取1 mL“2.1.3”項(xiàng)下樣液于具塞試管中，按“2.1.5”項(xiàng)下方法操作，在490 nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)吸光度從回歸方程求出樣品的含量，該批三七粗多糖平均含量是30.22%，RSD=0.7827%，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2?蒽酮硫酸法測(cè)定三七粗多糖含量

2.2.1?對(duì)照品溶液的制備?按“2.1.1”操作，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2?三七粗多糖樣液的制備?按“2.1.2”“2.1.3”項(xiàng)操作，即得供試樣液。

2.2.3?蒽酮硫酸的配制?稱(chēng)取0.33 g蒽酮，加100 mL濃硫酸，搖勻，置于棕色瓶中保存。

2.2.4?供試溶液的配制?準(zhǔn)確吸取1 mL的“2.2.2”項(xiàng)下的多糖樣液，再加入“2.2.3”項(xiàng)下的4 mL蒽酮硫酸，快速置于冰水浴中搖勻，然后置于沸水浴中加熱10min，觀察顏色變化，之后用冰水浴迅速冷卻至室溫，即得供試液。

2.2.5?標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制?準(zhǔn)確吸取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，加水補(bǔ)足1 mL，按“2.2.4”項(xiàng)下方法操作，在620 nm處測(cè)定其吸收值，以吸光度A為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度ρ為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：A=5.1337ρ-0.0430，R^2=0.9994，線(xiàn)性范圍是0.013～0.098 mg/mL。

2.2.6?精密度試驗(yàn)?精密吸取粗多糖樣液1 mL，按“2.2.4”項(xiàng)下方法操作，在620 nm處測(cè)定其吸收值，重復(fù)測(cè)定6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.66%，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.2.7?穩(wěn)定性試驗(yàn)?精密稱(chēng)取三七粗多糖0.3 g，按“2.2.2”、“2.2.4”項(xiàng)下方法操作，分別在10、20、30、40、50、60 min測(cè)定吸光度。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.073%，表明加入蒽酮、硫酸的供試溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.2.8?回收率試驗(yàn)?精密量取0.3 mL供試液三份，分別加入0.1、0.2、0.3 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水補(bǔ)足1 mL，按“2.2.4”項(xiàng)下方法操作，在620 nm處測(cè)定其吸光度，按公式計(jì)算加樣回收率，平均回收率為97.6%，RSD=0.95%，結(jié)果見(jiàn)表7。

2.2.9?三七粗多糖的含量?測(cè)定精密吸取1 mL“2.2.2”項(xiàng)下樣液于具塞試管中。按“2.2.4” 項(xiàng)下方法操作，在波長(zhǎng)為620 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度從回歸方程求出三七粗多糖的含量是29.77%，RSD=1.17%，結(jié)果見(jiàn)表8。

3?討論

實(shí)驗(yàn)開(kāi)展了對(duì)三七廢棄物的綜合利用研究，從廢棄物中提取三七多糖。三七粗多糖含量的測(cè)定方法一般有比色法、3-5-二硝基水楊酸比色法以及傅里葉變換紅外光譜（FTIR）結(jié)合支持向量機(jī)回歸 硫酸-苯酚法、蒽酮-硫酸（SVR）法[6]，課題組用兩種便于生產(chǎn)企業(yè)常用的硫酸-苯酚法、蒽酮-硫酸法測(cè)定了三七粗多糖含量;比較了苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法在測(cè)定三七多糖含量中的優(yōu)劣。對(duì)于三七粗多糖，比較表1和表5可知：從穩(wěn)定性來(lái)看，苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法均適合于三七粗多糖含量的測(cè)定。比較表2和表6可知：從精密度的角度來(lái)看，苯酚硫酸法較蒽酮硫酸法可靠。比較表3和表7可知：從加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，使用苯酚硫酸法測(cè)定時(shí)，回收率更高。因此，苯酚硫酸法較之蒽酮硫酸法，操作更簡(jiǎn)便、安全、快捷。因此，選用苯酚硫酸法測(cè)定三七粗多糖含量較優(yōu)。

三七多糖單糖組分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，文獻(xiàn)一級(jí)表征結(jié)構(gòu)表明三七多糖主要由葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖組成[7]，實(shí)際實(shí)驗(yàn)分析和生產(chǎn)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)三七粗多糖進(jìn)行微孔濾膜截留得到不同段次三七多糖，分子量大的3～5萬(wàn)，分子量小的幾千[8-9]，經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分子量小的多糖以葡萄糖為對(duì)照，測(cè)定則多糖含量非常低，薄層鑒別發(fā)現(xiàn)、乳糖，阿拉伯糖點(diǎn)非常濃。同樣的對(duì)粗多糖進(jìn)行脫蛋白、脫淀粉、脫氨基酸、脫鹽處理后含量也僅僅能達(dá)到70%～80%左右，由此可知由于三七多糖單糖組分的復(fù)雜性，選擇單一葡萄糖為對(duì)照，采用廣譜的紫外分關(guān)光度法測(cè)定，仍然具有一定的極限性，還有很多工作要做。

三七多糖含量測(cè)定方法研究有利于三七多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善，對(duì)進(jìn)一步深入研究我國(guó)特有三七資源、提高其附加值、增加種植戶(hù)收入做出積極貢獻(xiàn)，具有較好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，也可給人們提供新的保健品，為人類(lèi)健康做出貢獻(xiàn)。

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（收稿日期：2020-04-21）