不同pH條件下五倍子中β-PGG水解產(chǎn)物分析及其含量研究

張艷嬌 楊玲 向潤清 黃寬 方山丹 范源 朱培芳

摘要：目的?研究并分析β-PGG、3GG、GA、PA等在不同pH磷酸鹽緩沖液中的含量變化及β-PGG水解產(chǎn)物分析情況。方法?采用經(jīng)典恒溫法考察β-PGG、GA、PA在不同pH緩沖液（pH=2、3、4、5、6、7、8）中的水解情況，用RP-HPLC法在同一色譜條件下對(duì)β-PGG水解產(chǎn)物進(jìn)行分析及含量測定。結(jié)果?在同一色譜條件下發(fā)現(xiàn)β-PGG分解為GA和少量3GG之外，同時(shí)考察了GA在不同緩沖溶液中的產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)GA可生成少量3GG及PGG，未見PA分解。結(jié)論?β-PGG及GA、PA在不同pH條件下的含量變化反映了不同酸堿度對(duì)β-PGG水解反應(yīng)的影響;本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)β-PGG可分解為GA，3GG;GA在一定的條件下會(huì)合成3GG及β-PGG。目前文獻(xiàn)多報(bào)道β-PGG的合成，其在不同PH條件下分解的產(chǎn)物及產(chǎn)物含量變化的研究報(bào)道較少，本研究有助于了解β-PGG的化學(xué)穩(wěn)定性及其分解產(chǎn)物的相關(guān)性，可為進(jìn)一步研究β-PGG的理化特性及鞣質(zhì)類中藥的養(yǎng)護(hù)、儲(chǔ)存、加工及臨床應(yīng)用提供一定參考。

關(guān)鍵詞：β-PGG;1，3，6-Tri-O-galloylglucose;沒食子酸;焦性沒食子酸;pH緩沖液;水解反應(yīng)

中圖分類號(hào)：R285?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：1007-2349（2020）08-0054-05

【Abstract】Objective： To study and analyze the content changes and β-PGG hydrolysates of β-PGG， 3GG， GA and PA in different pH phosphate buffers.?Methods： The classic constant temperature method was used to investigate the hydrolysis of β-PGG， GA， and PA in different pH buffers （pH=2， 3， 4， 5， 6， 7， and 8）.?The RP-HPLC method was used under the same chromatographic conditions.?Results： Under the same chromatographic conditions， it was found that β-PGG was decomposed into GA and a small amount of 3GG.?At the same time， the product analysis of GA in different buffer solutions was investigated and GA was found to generate a small amount of 3GG and PGG， and no PA decomposition was seen.?Conclusion： The content changes of β-PGG， GA and PA under different pH conditions reflect the influence of different pH on the hydrolysis reaction of β-PGG.?This experiment also find that β-PGG can be decomposed into GA and 3GG and GA under certain conditions can synthesize 3GG and β-PGG.?At present， the literature mostly reports the synthesis of β-PGG， and few research reports on its decomposition products and product content changes under different pH conditions.?This study helps to understand the chemical stability of β-PGG and the correlation of its decomposition products and can provide a reference for further research on the physical and chemical properties of β-PGG and the maintenance， storage， processing and clinical application of tannin Chinese medicine.

【Key words】β-PGG， 1，3，6-Tri-O-galloylglucose， gallic acid， pyrogallic acid， pH buffer， hydrolysis reaction

1，2，3，4，6-五-O-沒食子?；咸烟牵?，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose，β-PGG）屬天然水解類鞣質(zhì)，是單寧類中最有效的抗氧化劑之一，來自于多種藥用植物，如五倍子、芍藥、余甘子等。β-PGG具有廣泛的生物活性和藥理活性，如抗炎癥、抗氧化、抗糖尿病等作用[1-4]，其能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]、防止突變、轉(zhuǎn)移和新生血管生成[6-8]。β-PGG在治療各種癌癥方面具有良好效應(yīng)，包括肝癌[9-10]、乳腺癌[11]、結(jié)腸癌[12-13]、腎癌[14]和前列腺癌[15-16]等。β-PGG對(duì)癌細(xì)胞的選擇性殺傷作用極其重要，它抗腫瘤和抗糖尿病等作用需要進(jìn)一步探索以充分發(fā)揮其潛力，故研究β-PGG及其水解產(chǎn)物的化學(xué)特性及藥效學(xué)特性有較為重要的意義。

β-PGG是5個(gè)沒食子酸與1個(gè)葡萄糖酯化反應(yīng)的產(chǎn)物，在該反應(yīng)過程中沒食子酸（gallic acid，GA）與葡萄糖上的羥基結(jié)合，逐步生成二沒食子酰葡萄糖、三沒食子酰葡萄糖、四沒食子酰葡萄糖和五沒食子酰葡萄糖，其在pH值為5～6范圍內(nèi)較穩(wěn)定，在pH值為7.0條件下分解[17]。β-PGG在酸、堿條件下水解過程與上述酯化過程相反，分解為1，3，6-Tri-O-galloylglucose（3GG），最終水解為GA。GA在五倍子、蘇木、金縷梅、茶葉、橡樹樹皮和其他植物中大量存在，具有清除自由基的能力，是一種優(yōu)良的抗氧化劑，具有廣譜的治療作用，包括抗腫瘤[18-19]、抗炎[20-21]、抗肥胖[22]、抗菌和抗糖尿病[23-27]等。目前其主要藥用用途包括鎮(zhèn)痛劑、收斂劑和抗菌藥物，研究發(fā)現(xiàn)它和它的酯類衍生物可作為一種有價(jià)值的抗癌藥物[28-29]。焦性沒食子酸（Pyrogallol Acid，PA），又稱鄰苯三酚、焦醅酚、焦棓酸，是存在于許多植物果實(shí)中的天然多酚類化合物，其多應(yīng)用于農(nóng)藥、合成醫(yī)藥、顯影劑以及化學(xué)分析試劑等，是許多藥物的有效成分和重要的抗氧化劑;GA經(jīng)過化學(xué)法脫羧反應(yīng)后得PA，也可利用生物法在沒食子酸脫羧酶的作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)生成PA[30-31]?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

本實(shí)驗(yàn)將根據(jù)多酚類化合物的特性考察在同一HPLC色譜條件不同pH對(duì)β-PGG、GA分解和或合成產(chǎn)物及產(chǎn)物含量分析。

1?材料

1.1?試劑?甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲醇（分析純）、磷酸（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）等購自云南丹赤貿(mào)易有限公司;純凈水購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰葡萄糖（委托成都普瑞法科技開發(fā)公司從五倍子中提取，共2.5g，含量≥98%）成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;1，3，6-Tri-O-galloylglucose（批號(hào)：CFN95043，含量≥98%），武漢天植生物技術(shù)有限公司;沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：16081904，含量≥98%），四川省維克奇生物科技有限公司;焦性沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：16052801，含量≥98%），上海源葉生物科技有限公司。

1.2?儀器?Agilent 1200系列高效液相色譜儀（VWD 紫外檢測器），美國安捷倫公司;FA1004N型1/1萬電子分析天平，上海菁海儀器有限公司;YL-080ST型超聲清洗機(jī)，深圳市語路清洗設(shè)備有限公司;酸度計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器廠。

2?方法

2.1.1?磷酸鹽緩沖液的配制?A液：取磷酸10mL，加純化水至100mL，搖勻。B液：稱取磷酸氫二鈉7.2g，加純化水使溶解成100mL。分別取不同體積的A，B液用酸度計(jì)調(diào)pH值到2、3、4、5、6、7、8，分別置于50mL容量瓶中，備用。

2.1.2?對(duì)照品溶液的制備?分別精密稱取對(duì)照品β-PGG 2.3mg，3GG 2.2mg，GA 3.1mg，PA 2.6mg置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，備用。

2.1.3?供試品溶液的制備?考察β-PGG、GA在pH為3、4、5、6、7、8時(shí)的緩沖液分解產(chǎn)物。稱取β-PGG、GA對(duì)照品各2.6mg分別于12個(gè)10mL容量瓶中，超聲使其溶解之后，置于60℃～65℃水浴鍋上保存12h后用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得供試品溶液。

2.1.4?色譜條件?色譜柱ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm，5μm）;柱溫25℃;檢測波長280nm;流速1mL/min;進(jìn)樣量10μL;乙腈和0.1%磷酸梯度洗脫，洗脫程序見表1。

2.1.5?測定不同pH條件下β-PGG、GA分解和或合成產(chǎn)物的含量變化?使用色譜柱ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm，5μm），按表4色譜條件，取2.2.1對(duì)照品分別2、4、6、8、10、12、14、16μL不同體積進(jìn)樣，以其峰面積（Y）對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量（X）測得β-PGG、3GG、GA、PA的線性范圍如表5所示，其精密度分別為1.14、1.14、1.54、1.53%;同時(shí)測定2.2.2供試品溶液的含量變化如表6所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一色譜條件不同pH條件下，β-PGG可分解為3GG、GA，未見PA分解;GA也可分解，同時(shí)觀察到GA在一定的pH情況下還會(huì)合成3GG、β-PGG，未見PA分解，見圖3。

3?結(jié)果與討論

3.1?實(shí)驗(yàn)結(jié)果?根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知β-PGG在酸性條件下較為穩(wěn)定，隨著pH增大，其分解較快，結(jié)合第二部分實(shí)驗(yàn)，pH越大，分解生成3GG、GA的含量也增加;對(duì)于GA，酸性條件時(shí)，含量變化不大，至但隨著pH增大，其降解生成3GG、β-PGG的含量隨之增大，但pH為8時(shí)，未見任何化合物的生成，這可能與酸堿度對(duì)其影響較大，故迅速降解有關(guān)。

3.2?存在問題及展望?本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用同一色譜條件將β-PGG、3GG、GA、PA分解出來，但是峰形還需進(jìn)一步改善;其次，本實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)GA在隨著pH增大時(shí)，其顏色逐漸變?yōu)榫G色、深綠色，在60℃加熱12h后，其顏色未發(fā)生較大變化，沒有考察加熱對(duì)其分解的影響，之后還應(yīng)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。

β-PGG、GA存在于多種鞣質(zhì)類中藥，研究不同酸堿度對(duì)其影響有助于了解β-PGG、GA的化學(xué)穩(wěn)定性、提高其生物利用度，為進(jìn)一步研究β-PGG的理化性質(zhì)，將其更好地用于臨床及鞣質(zhì)類中藥的養(yǎng)護(hù)、儲(chǔ)存、加工及臨床應(yīng)用提供一定參考依據(jù)。

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（收稿日期：2020-06-26）