脂質(zhì)運(yùn)載蛋白型前列腺素D合成酶水平在1型發(fā)作性睡病患者日間過度嗜睡中的作用研究

王配配，閆涵，李清華，張馳，董霄松，安海燕，李靜，趙龍，韓芳

發(fā)作性睡病是一種罕見的嚴(yán)重慢性睡眠障礙（發(fā)病率約為0.06%），臨床上以不可抗拒的日間過度嗜睡（EDS）和夜間睡眠片段化為主要特點(diǎn)，多于兒童或青年期起病，嚴(yán)重影響患者的學(xué)習(xí)、情緒及生活質(zhì)量，甚至釀成意外事故而危及生命［1］。1999年LIN等［2］的動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦分泌素（HCRT）受體2或HCRT配體的突變可導(dǎo)致發(fā)作性睡病，人類發(fā)作性睡病則由HCRT細(xì)胞特異性損傷導(dǎo)致。尸檢發(fā)現(xiàn)患者HCRT細(xì)胞損傷達(dá)90%～95%，腦脊液（CSF）HCRT水平很低或者檢測(cè)不到［3-4］。2014年頒布的第三版《睡眠障礙國際分類》根據(jù)有無猝倒及HCRT缺乏情況將發(fā)作性睡病分為1型（NT1，即伴有猝倒和/或HCRT缺乏）和2型（NT2，即不伴有猝倒和HCRT缺乏），該類患者就診的首要原因是EDS［5-6］，但目前EDS發(fā)病機(jī)制尚待探索。具有促醒作用的HCRT降低從而導(dǎo)致日間清醒維持困難是NT1發(fā)病的核心機(jī)制［7］，但HCRT缺乏并不能解釋NT2等無HCRT缺乏患者的EDS［8］。外周循環(huán)中HCRT水平極低（低于監(jiān)測(cè)水平）不適宜作為評(píng)估EDS的生物學(xué)指標(biāo)。近年來研究顯示多種內(nèi)源性促眠分子及遞質(zhì)可通過對(duì)視前區(qū)或相鄰基底前腦神經(jīng)元直接作用而維持睡眠［9］。前列腺素D2（PGD2）被認(rèn)為是強(qiáng)效內(nèi)源性促眠物質(zhì)之一，PGD2和其受體（DP1）激動(dòng)劑均可誘導(dǎo)生理性睡眠，前列腺素抑制劑SeCl4通過抑制PGD2合成量依賴性的抑制睡眠時(shí)長，持續(xù)灌注DP1拮抗劑ONO-4127Na能夠有效維持正常小鼠和發(fā)作性睡病小鼠的清醒狀態(tài)［10］。SADAM等［11］采用通量抗體篩查研究發(fā)現(xiàn)發(fā)作性患者DP1自身抗體顯著增高，提示PGD2-DP1通路異常參與了發(fā)作性睡病的發(fā)病過程。PGD2由大腦中前列腺素H2（PGH2）經(jīng)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白型前列腺素D合成酶（L-PGDS）轉(zhuǎn)化形成，因化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定其組織濃度依賴于局部組織L-PGDS的表達(dá)水平［12］。CSF中L-PGDS含量豐富，濃度僅次于清蛋白。血清中的L-PGDS主要來源于中樞，大約為腦脊液中的1/30。研究表明，伴EDS的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）患者的血清L-PGDS水平較正常人升高，而無EDS主訴的OSAHS患者血清L-PGDS水平則與正常人并無差異，同時(shí)L-PGDS水平與呼吸暫停低通氣指數(shù)（AHI）無關(guān)，提示L-PGDS可能參與了OSAHS患者EDS的發(fā)生［13］。目前L-PGDS水平和發(fā)作性睡病患者EDS的關(guān)系尚未明確，幾個(gè)小樣本研究的結(jié)果也不一致［14-15］。本研究將通過比較NT1患者與對(duì)照CSF和血清的L-PGDS水平，探索其在NTI患者中的變化以及其在NT1患者EDS發(fā)病中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2013年12月—2015年12月北京大學(xué)人民醫(yī)院睡眠中心收治的79例發(fā)作性睡病患者，均符合NT1的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］，即患者存在白天難以抑制的犯困，癥狀持續(xù)至少3個(gè)月以上；CSF中HCRT≤110 ng/L；患者均完成整夜多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)（nPSG）和日間多次睡眠潛伏期試驗(yàn)（MSLT），并根據(jù)美國睡眠醫(yī)學(xué)會(huì)2012評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［16］進(jìn)行人工手動(dòng)判讀，nPSG根據(jù)美國睡眠醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)的推薦方法［17］記錄腦電圖（F3M2、F4M1、C3M2、C4M1、O1M2、O2M1）、 雙側(cè)眼電圖、下頜肌電圖、口鼻熱敏信號(hào)、鼻氣流壓力、胸腹呼吸運(yùn)動(dòng)、心電圖、鼾聲、體位、雙側(cè)脛前肌電圖、脈搏血氧飽和度、心率。排除其他可能導(dǎo)致嗜睡的疾病，如其他睡眠障礙性疾病、精神疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或藥物的影響?；颊咴谠u(píng)估時(shí)均未服用任何藥物。選取同期就診于北京大學(xué)人民醫(yī)院行腿部手術(shù)接受蛛網(wǎng)膜下腔阻滯麻醉（腰麻）的47例患者作為對(duì)照組，均不存在日間嗜睡；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并OSAHS（AHI＞5次/h）；存在心腦血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎臟疾病史和吸煙史等影響L-PGDS水平的因素。本研究經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 臨床評(píng)估 收集研究對(duì)象一般資料（年齡、性別、BMI）。MSLT在nPSG檢查的第2天進(jìn)行，患者早晨7：30進(jìn)入睡眠監(jiān)測(cè)室準(zhǔn)備，8：00開始測(cè)試。每隔2 h睡眠30 min，共進(jìn)行5次，據(jù)此計(jì)算睡眠潛伏期（SL）及睡眠起始快速眼動(dòng)睡眠（SOREMPs）次數(shù)。

1.3 血 清 L-PGDS，CSF中 L-PGDS、HCRT水 平 及HLA-DQB1*0602表型檢測(cè) 研究對(duì)象均在10：00am～1：00pm采集靜脈血及CSF。CSF和血清樣品等分為200 μl后于 -80 ℃冰箱凍存，CSF HCRT 通過125I放射免疫分析試劑盒檢測(cè)，具體步驟參考文獻(xiàn)［18］。L-PGDS采用ELISA試劑盒檢測(cè)，具體方法步驟參考文獻(xiàn)［19］。樣品均一式兩份測(cè)量，取兩次檢測(cè)的平均值。采用淋巴細(xì)胞分離液分離5 ml全血中的白膜用以檢測(cè)HLA-DQB1*0602表型。HLA-DQB1*0602檢測(cè)引物：上游引物：5′-CGTGCGTCTTCTGACCAGAT-3′；下游引物：5′GCTGTTCCAGTACTCGGCAT-3′。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目標(biāo)條帶陽性者被視為攜帶HLA-DQB1*0602基因，檢測(cè)由北京博富瑞基金診斷技術(shù)有限公司完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料及睡眠監(jiān)測(cè)結(jié)果 兩組年齡、性別、BMI和HLA-DQB1*0602陽性比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。NT1組 SL為（4.2±2.4）min，SOREMPs為（4.3±1.1）次。

2.2 CSF HCRT、CSF和血清 L-PGDS水平 對(duì)照組CSF HCRT水平高于NT1組，CSF和血清L-PGDS水平低于NT1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，見表2）。NT1組（rs=-0.160，P=0.159）、對(duì)照組（rs=-0.179，P=0.229）CSF L-PGDS 水平與 CSF HCRT 水平均無相關(guān)關(guān)系。

2.3 CSF L-PGDS、血清 L-PGDS與年齡、BMI的相關(guān)性分析 對(duì)照組（rs=0.358，P=0.014）和NT1組（rs=0.267，P=0.017）年齡與 CSF L-PGDS水平均呈正相關(guān)。對(duì)照組（rs=-0.251，P=0.088）和NT1組（rs=-0.058，P=0.612）年齡與血清L-PGDS水平無相關(guān)關(guān)系。對(duì)照組CSF L-PGDS（rs=-0.097，P=0.521）及血清L-PGDS（rs=-0183，P=0.220）與BMI均無相關(guān)關(guān)系，NT1 組 CSF L-PGDS（rs= 0.122，P =0.283）血清 L-PGDS（rs=0.188，P=0.098）與BMI均無相關(guān)關(guān)系。對(duì)照組男、女性 CSF L-PGDS分別為 11.438（10.114，13.916）、14.331（10.771，17.047）mg/L，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.90，P=0.366）；NT1組男、女性CSF L-PGDS分別為 16.215（12.009，20.505）、14.375（9.643，17.964）mg/L，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.32，P=0.218）。對(duì)照組男、女性血清L-PGDS分別為0.469（0.400，0.543）、0.385（0.333，0.493）mg/L，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.55，P=0.122）；NT1組男、女性血清L-PGDS分別 為 0.657（0.529，0.778）、0.591（0.536，0.675）mg/L，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.721，P=0.471）。對(duì)NT1組和對(duì)照組年齡、性別及BMI進(jìn)行1∶1匹配，獲得12組配對(duì)樣本。匹配后，對(duì)照組和NT1組CSF L-PGDS、血清L-PGDS比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組和NT1組年齡、BMI比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表3）。相對(duì)于未匹配的樣本中兩組間 CSF L-PGDS 的差異（ΔCSF L-PGDS =3.656 mg/L），匹配后樣本中兩組間CSF L-PGDS的差異有一定程度的增加（ΔCSF L-PGDS =9.491 mg/L）。

表1 兩組一般資料比較Table 1 Demographic and clinical features of subjects in NT1 group and control group

表2 兩組CSF中HCRT、L-PGDS 和血清L-PGDS水平比較Table 2 CSF hypocretin，CSF-LPGDS and serum L-PGDS in NT1 group and control group

3 討論

發(fā)作性睡病為罕見病，大眾及臨床工作者知曉率均非常低，患者的臨床表現(xiàn)經(jīng)常被誤解或誤診，進(jìn)一步增加了患者及家庭的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。BASSETTI等［20］綜述了不同病程及嚴(yán)重程度發(fā)作性睡病的臨床特征提出發(fā)作性睡病包括多種臨床表型譜，涵蓋輕度EDS至伴猝倒的嚴(yán)重EDS，而臨床就診者多為臨床表型偏重的患者，大部分輕型患者尚未被診治，導(dǎo)致現(xiàn)階段報(bào)道的發(fā)病率顯著低于實(shí)際發(fā)病率。但目前發(fā)作性睡病的診斷依賴復(fù)雜的nPSG、MSLT（此兩項(xiàng)檢查均需要含腦電的多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)儀，結(jié)果需要專業(yè)睡眠技師判讀）以及CSF HCRT的檢測(cè)，限制了臨床尤其是基層工作者對(duì)本病的認(rèn)識(shí)和診療能力，簡(jiǎn)便客觀評(píng)估EDS的方法將有效改善此種狀況。近年來研究顯示內(nèi)源性促眠物質(zhì)PGD2及其相關(guān)通路可能參與了EDS的發(fā)生發(fā)展。PGD2通過其受體DP1增強(qiáng)腺苷的作用而誘發(fā)生理性睡眠，調(diào)節(jié)睡眠的起始、維持及睡眠深度［12］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中PGD2由脈絡(luò)叢、軟腦膜和少突膠質(zhì)細(xì)胞中的L-PGDS合成［21］。組織局部PGD2水平受L-PGDS表達(dá)水平調(diào)控［22-23］。健康人群中血清L-PGDS水平呈晝夜節(jié)律改變，白天較低，夜間隨著睡眠張力的增加而增高［24］。睡眠剝奪時(shí)，L-PGDS的晝夜節(jié)律消失，呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢(shì)［14，24］。本研究通過比較79例發(fā)作性睡病患者和47例正常對(duì)照血清和CSF L-PGDS水平發(fā)現(xiàn)NT1患者的CSF和血清中促眠物質(zhì)L-PGDS 均顯著升高。

表3 匹配后兩組一般資料、CSF L-PGDS、血清L-PGDS水平比較Table 3 CSF and serum L-PGDS levels in a subgroup of age-，genderand BMI-matched NT1 patients and controls

既往有關(guān)發(fā)作性睡病患者L-PGDS水平的研究并未得到一致結(jié)論：JORDAN等［14］比較了14例發(fā)作性睡病患者和14例正常對(duì)照的血清L-PGDS水平，發(fā)現(xiàn)發(fā)作性睡病患者和正常對(duì)照呈現(xiàn)相同的節(jié)律性改變，但發(fā)作性睡病患者的血清L-PGDS水平整體高于正常對(duì)照組。另一研究卻得出了相反的結(jié)論，BASSETTI等［15］比較了10：00am～1：00pm采集的發(fā)作性睡病患者（n=14）和對(duì)照（n=22）的CSF L-PGDS，發(fā)現(xiàn)發(fā)作性睡病患者 CSF L-PGDS明顯低于對(duì)照〔（14.7±3.8）mg/L vs（21.3±6.8）mg/L〕。兩項(xiàng)研究結(jié)論不一致可能是由于 BASSETTI等［15］的研究中對(duì)照組 CSF L-PGDS水平偏高所致（11.7～36.8 mg/L，平均為 21.3 mg/L），明顯高于既往多項(xiàng)研究中正常人的CSF L-PGDS（6.8～26.5 mg/L，平均14.9 mg/L）［24-25］。本研究首次同時(shí)檢測(cè)了NT1患者CSF L-PGDS及血清L-PGDS，同時(shí)為最大限度避免L-PGDS水平受晝夜節(jié)律的影響，將采樣時(shí)間限制在10：00am～1：00pm。本研究中L-PGDS水平結(jié)果可靠還體現(xiàn)在：（1）CSF、血清L-PGDS的平均水平與既往多項(xiàng)研究報(bào)道的結(jié)果一致［24-25］；（2）CSF L-PGDS水平與對(duì)照組年齡呈正相關(guān)，這一結(jié)論與之前發(fā)表的研究結(jié)果一致［25］；（3）本研究排除了OSAHS、心血管疾病、神經(jīng)疾病、腎臟疾病及吸煙等已知可影響L-PGDS表達(dá)的因素。

本研究結(jié)果顯示，兩組年齡、性別及BMI均有差異，為此分別探索年齡、性別和BMI對(duì)L-PGDS的影響發(fā)現(xiàn)，CSF L-PGDS水平隨著年齡增加而增加；性別和BMI不影響CSF L-PGDS水平，和既往報(bào)道一致［25-26］。本研究中對(duì)照組受試者年齡高于NT1組，推測(cè)年齡匹配后兩組之間的CSF L-PGDS差距將進(jìn)一步加大，因此本研究嚴(yán)格匹配了12對(duì)患者及對(duì)照組受試者（年齡、性別及BMI），進(jìn)一步證實(shí)了發(fā)作性睡病患者CSF和血清L-PGDS水平高于對(duì)照組，且兩組間CSF L-PGDS水平差異較不匹配時(shí)增大近3倍。

HCRT是下丘腦外側(cè)和背側(cè)部分神經(jīng)元分泌的神經(jīng)遞質(zhì)（33個(gè)氨基酸的HCRT1和28個(gè)氨基酸的HCRT2），1998年由 DE LECEA等［27］和SAKURAI等［28］兩個(gè)團(tuán)隊(duì)同時(shí)發(fā)現(xiàn)。HCRT能接受來自大腦皮質(zhì)、邊緣系統(tǒng)以及腦干的神經(jīng)投射，其發(fā)出的軸突可投射至腹側(cè)被蓋區(qū)、伏隔核、基底前腦、藍(lán)斑、杏仁核、網(wǎng)狀系統(tǒng)等，在覺醒維持中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，NT1組或?qū)φ战M中CSF-LPGDS水平均和CSF HCRT無相關(guān)性，提示發(fā)作性睡病患者的L-PGDS不是繼發(fā)于HCRT缺乏，因本研究采用橫斷面設(shè)計(jì)，不能對(duì)L-PGDS增高的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步深入探索，有待于下一步通過藥物干預(yù)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

發(fā)作性睡病多是一種終身疾病，于兒童時(shí)期起病，可嚴(yán)重影響患者成長及生活質(zhì)量，甚至危及生命。及早正確診療可有效改善患兒學(xué)習(xí)和生活狀態(tài)，但該病的人群知曉率均較低，以致患者診療不及時(shí)、誤診率高。目前對(duì)于這一大類疾病的診斷和鑒別診斷主要依靠癥狀和電生理檢查，缺乏簡(jiǎn)便的可普及的生物標(biāo)記物。本研究發(fā)現(xiàn)NT1患者的血清和CSF L-PGDS水平較對(duì)照組明顯增高，提示L-PGDS在EDS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的病理生理作用，為探索血清L-PGDS作為評(píng)估EDS的新型生物標(biāo)志物、研發(fā)診療試劑盒提供了理論依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：王配配進(jìn)行研究設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；閆涵進(jìn)行研究設(shè)計(jì)、資料整理、質(zhì)量控制、審校并對(duì)文章負(fù)責(zé)；李清華、張馳、安海燕、李靜、趙龍進(jìn)行研究實(shí)施、評(píng)估、資料收集、統(tǒng)計(jì)分析；董霄松、韓芳進(jìn)行研究設(shè)計(jì)、質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。