黏蛋白1基因單核苷酸rs4072037多態(tài)性對結締組織病相關間質性肺疾病的影響及預測價值研究

龍小平，唐艷華，許麗慧，王衛(wèi)忠，李建民，謝立虎

結締組織病（CTD）是一類可累及全身多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，包括類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及多肌炎/皮肌炎等疾病，臨床上常累及肺間質，稱為結締組織病相關間質性肺疾?。–TD-ILD），全球患病率為3%～5%［1］，嚴重影響患者預后。因此，早期診斷、早期治療，對于CTD-ILD患者至關重要。人Ⅱ型肺泡上皮細胞表面抗原6（KL-6）屬于黏蛋白1（MUC1）家族的黏蛋白樣糖蛋白［2］。KL-6對纖維母細胞有著很強的趨化作用，在纖維化的發(fā)生過程中起重要作用。近年來研究提示，血清KL-6是間質性肺炎（ILD）的敏感生物學標志物，其可用于特發(fā)性肺纖維化（IPF）、結節(jié)病和囊性纖維化的疾病診斷、病情嚴重程度判斷及預后評估［3-4］。但目前尚未見KL-6在CTD-ILD中作用的相關報道。前期研究表明，ILD患者血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中和血清KL-6水平較健康對照組明顯升高［5］。MUC1基因單核苷酸rs4072037多態(tài)性與血清KL-6水平的個體差異有關［2］，血清KL-6水平是肺泡蛋白沉積癥患者疾病進展和全肺灌洗治療的強預測因子［6］。然而，沒有關于CTD-ILD患者MUC1 rs4072037基因相關數據，MUC1 rs4072037基因多態(tài)性是否會影響血清KL-6水平尚不明確。本研究通過回顧性收集CTD-ILD患者的資料，探討CTD-ILD患者MUC1 rs4072037基因多態(tài)性和血清KL-6水平、肺功能之間的相關性，明確其是否可作為評價CTD-ILD疾病嚴重程度及預后的指標。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年1月—2018年12月南華大學附屬第一醫(yī)院風濕免疫科住院診治的CTD-ILD患者48例（系統(tǒng)性紅斑狼瘡16例、類風濕關節(jié)炎10例、系統(tǒng)性硬化癥10例、多肌炎/皮肌炎6例、干燥綜合征6例，肺部緩解期29例、進展期19例），其中男28例，女20例；年齡21～71歲，平均年齡（46.1±12.2）歲；吸煙18例，不吸煙30例；體質指數（BMI）19～35 kg/m2，平均（26.2±5.4）kg/m2。單純CTD患者13例（系統(tǒng)性紅斑狼瘡3例、多肌炎/皮肌炎3例、干燥綜合征3例、類風濕關節(jié)炎2例、系統(tǒng)性硬化癥2例），其中男7例，女6例；年齡29～70歲，平均年齡（45.9±11.3）歲；吸煙11例，不吸煙2例；BMI 19～35 kg/m2，平均（25.1±5.1）kg/m2。另外選取同期本院門診自愿參與本研究的健康體檢者30例作為對照組，其中男11例，女19例；年齡 20～60歲，平均年齡（41.3±11.3）歲；吸煙者4例，不吸煙者26例；BMI 18～35 kg/m2，平均（24.4±1.5）kg/m2。3 組患者性別、年齡、吸煙史、BMI比較，差異均無統(tǒng)計學意義（χ2=3.757，P=0.153；F=1.750，P=0.180；F=1.610，P=0.207；χ2=20.006，P＜0.001）。本研究經過南華大學醫(yī)學倫理委員會審批（編號：14-5863-BO），患者均簽署知情同意書。

ILD診斷標準（至少符合3項）：（1）主要癥狀及體征，如發(fā)熱、咳嗽、漸進性勞力性胸悶及呼吸困難，體格檢查以雙肺velcro音為主；（2）肺功能檢查均提示，限制性通氣功能障礙，且彌散功能障礙；（3）肺部高分辨率CT（HRCT）提示毛玻璃樣改變，且未提示網格狀、蜂窩樣改變；（4）病理結果提示：尋常型間質性肺炎（UIP）者；（5）多為無痰或少量白痰，且連續(xù)3次痰病原學檢查及培養(yǎng)為陰性；（6）經呼吸科-放射科-病理科專家會診認同，且除外其他病因所致繼發(fā)性ILD。排除標準：其他ILD（IPF、過敏性肺炎、放射性肺炎、結節(jié)?。?、結核病及惡性腫瘤的患者。

1.2 疾病進展定義 患者自訴癥狀惡化（呼吸困難惡化、咳嗽、胸痛和體質量減輕）和/或肺功能〔用力肺活量占預計值百分比（FVC% pred）減少＞10%和/或一氧化碳彌散量占預計值百分比（DLCO% pred）減少＞15%〕和/或肺部HRCT出現新的滲出病灶。反之，患者被認為病情穩(wěn)定或緩解。

1.3 研究方法

1.3.1 肺功能檢查 使用德國耶格MasterScreen PFT System肺功能儀測定肺功能，測量指標包括：FVC% pred、第1秒用力呼氣末容積占預計值百分比（FEV1% pred）、肺總容量占預計值百分比（TLC% pred）、DLco% pred、動脈血氧分壓（PaO2），采集血液樣品測定肺泡-動脈氧分壓差（A-aDO2）。

1.3.2 血清KL-6和乳酸脫氫酶（LDH）檢測方法 所有研究對象在接受第1次評估時留取靜脈血 3～5 ml，2～8 ℃ 冰箱靜置24 h 后留取上層血清樣品，-80 ℃儲存待測。按相關文獻［7］，通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測血清KL-6水平，參照試劑盒（美國TSZ生物貿易有限公司）說明書中的實驗步驟測定：取100 μl血清加入到預先被抗體包被的96孔板內，37 ℃孵育90 min；棄去板內液體，加入KL-6抗體，37 ℃續(xù)續(xù)孵育60 min。棄去板內液體，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃繼續(xù)孵育30 min。再用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗5次，加入3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液進行顯色。20 min后，加入TMB終止液，液體顏色由藍色轉為黃色。用酶標儀在450 nm處測定光密度值。檢測所有研究對象血清LDH水平。

1.3.3 MUC1 rs4072037的DNA制備和基因型分析

使用基于二氧化硅-膜的核酸純化試劑盒（Qiagen DNA Mini Kit，Qiagen，USA）從外周血白細胞中提取基因組DNA，并儲存在-80 ℃冰箱內。MUC1基因的rs4072037 G/A基因多態(tài)性檢測參考文獻［8-9］進行，采用序列特異性引物-聚合酶鏈式反應（PCR-SSPs）法進行基因分型。引物序列：Primer 1：5，-CTATGGGCAGAGAAGGAG-3′，Primer 2：5，-AGCTTGCATGACCAGAACCC-3′，Primer 3：5，-AGCTTGCATGACC -3′。PCR 擴增：每例樣品DNA一式兩份，由引物1、2的PCR反應得出的產物為G等位基因，由引物1、3的PCR反應得出的產物為A等位基因。

1.4 隨訪 主要采用電話預約，囑患者每間隔3～6個月到我院門診復查血常規(guī)、肝腎功能、血電解質、血氣分析、肺功能及肺部HRCT檢查等，以患者死亡作為研究的終點事件，隨訪截止時間為2019-07-31。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0進行數據分析。正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料用相對數表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法；Pearson的擬合優(yōu)度卡方檢驗和Fisher′s確切概率法用于檢驗Hardy-Weinberg平衡的偏差；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并通過 Log-rank檢驗評估生存曲線之間的差異；采用Cox比例風險回歸模型分析CTD-ILD的獨立影響因素，C統(tǒng)計量分析預測模型的檢驗效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組肺功能及血清學指標比較 3組FVC% pred、FEV1% pred、DLCO% pred、PaO2、A-aDO2、KL-6、LDH水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中 CTD組與 CTD-ILD組的 FVC% pred、FEV1% pred、PaO2低于對照組，A-aDO2、KL-6、LDH水平高于對照組，CTD-ILD組的DLCO% pred低于對照組與CTD組，CTD-ILD組的A-aDO2高于CTD組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3組間TLC% pred比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 CTD-ILD組和對照組MUC1 rs4072037基因頻率比較 CTD-ILD組患者A/A基因型22例、A/G基因型26例；對照組A/A基因型9例、A/G基因型12例、G/G基因型9例。兩組間MUC1 rs4072037基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=16.325，P＜0.001）。

2.3 CTD-ILD組和對照組不同基因型的血清KL-6、LDH水平比較 CTD-ILD組患者A/A基因型血清KL-6〔（8.09±1.68）U/L〕、LDH水平〔（372±40）U/L〕高于A/G基因型〔（2.40±4.64）U/L、（266±23）U/L〕，差異均有統(tǒng)計學意義（t=3.748、2.124，P=0.007、0.030）。對照組中不同基因型血清KL-6〔A/A：（0.25±0.03）U/L，A/G：（0.27±0.02）U/L，G/G：（0.34±0.04）U/L〕、LDH水平〔A/A：（204±14）U/L，A/G：（189±11）U/L，G/G：（197±6）U/L〕比較，差異均無統(tǒng)計學意義（F=1.967、0.651，P=0.159、0.529）。

2.4 CTD-ILD 組不同MUC1 rs4072037基因型的A-aDO2、DLCO% pred比較 A/G基因型患者的A-aDO2〔（35±3）mm Hg〕（1 mm Hg=0.133 kPa）低于A/A基因型〔（45±4）mm Hg〕，DLCO% pred（58%±3%）高于A/A基因型（40%±6%），差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.377，P=0.027；t=2.778，P=0.012）。

2.5 CTD-ILD患者MUC1 rs4072037基因型與疾病預后的相關性分析 A/A基因型患者的疾病進展率（54.5%）高于A/G基因型患者（23.1%），差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.006）。A/A組有2例患者死亡（1例呼吸衰竭，1例膿毒血癥），A/G組亦有2例死亡（1例呼吸衰竭，1例肺曲霉病并大咯血）。A/A基因型CTD-ILD患者與A/G基因型CTD-ILD患者的累積疾病進展率不同（χ2=9.242，P=0.008，見圖1）。

2.6 疾病預后影響因素的Cox比例風險回歸模型分析以rs4072037（G）（賦值：連續(xù)變量）、年齡（賦值：連續(xù)變量）、性別（賦值：男=1，女=2）、吸煙（賦值：是=1，否=2）及A-aDO2（賦值：連續(xù)變量）為自變量，以疾病緩解情況（緩解=1，進展=2）為因變量進行單因素Cox比例風險回歸模型分析，結果顯示，MUC1 rs4072037（G）、年齡、性別、吸煙不是疾病緩解率的影響因素（P＞0.05）。以rs4072037（G）（賦值：連續(xù)變量）為自變量，以CTD-ILD患者疾病緩解（緩解=1，進展=2）為因變量進行多因素Cox比例風回歸險模型分析結果顯示，MUC1 rs4072037（G）是疾病緩解率的影響因素（P＜0.05，見表2）。C統(tǒng)計分析結果顯示，當rs4072037（G）在具有協(xié)變量的模型中可以預測臨床緩解率（P=0.021）。

圖1 CTD-ILD患者不同MUC1 rs4072037基因型的累積疾病進展率曲線Figure 1 Cumulative disease progression in CTD-ILD patients by MUC1 rs4072037 polymorphism

表1 三組肺功能和血清學指標比較（±s）Table 1 Comparison of lung function and serological indices among three groups

表1 三組肺功能和血清學指標比較（±s）Table 1 Comparison of lung function and serological indices among three groups

注：CTD=結締組織病，CTD-ILD=結締組織病相關間質性肺疾病，FVC% pred=用力肺活量占預計值百分比，FEV1% pred=第1秒用力呼氣末容積占預計值百分比，TLC% pred=肺總容量占預計值百分比，DLCO% pred=一氧化碳彌散量占預計值百分比，PaO2=動脈血氧分壓，A-aDO2=肺泡-動脈氧分壓差，KL-6=人Ⅱ型肺泡上皮細胞表面抗原6，LDH=乳酸脫氫酶，1 mm Hg=0.133 kPa；與對照組比較，aP＜0.05；與CTD組比較，bP＜0.05

LDH（U/L）對照組 30 97±8 94±6 95±8 87±12 94±4 8±4 0.28±0.02 196±6 CTD 組 13 87±11a 83±10a 92±12 81±13 75±9a 18±6a 3.21±0.43a 237±14a CTD-ILD 組 48 81±17a 75±14a 90±16 64±21ab 70±15a 40±12ab 3.06±1.88a 315±26ab F值 10.197 8.254 0.956 9.354 5.673 17.231 26.428 7.895 P值 0.004 0.008 0.087 0.006 0.014 ＜0.001 ＜0.001 0.005組別 例數 FVC% pred（%）FEV1% pred（%）TLC% pred（%）DLCO% pred（%）PaO2（mm Hg）A-aDO2（mm Hg）KL-6（U/L）

表2 CTD-ILD患者疾病緩解率的影響因素的Cox比例風險回歸模型分析Table 2 Cox proportional hazards model analysis of influencing factors of remission rate in patients with CTD-ILD

3 討論

目前ILD的診斷主要依據HRCT、肺功能檢查及血氣分析等，但這些檢查易受其他病因的干擾，如肺部感染、慢性阻塞性肺疾病等，多項血清學指標如紅細胞沉降率（ESR）、C反應蛋白（CRP）及LDH等雖可反應ILD病情的活動程度，其靈敏度較高、但特異度較低。KL-6是屬于黏液素MUC1家族的高分子量糖蛋白，首先被建議作為肺癌、乳腺癌和胰腺癌的血清生物學標志物，但假陽性率高、準確性低于癌胚抗原［10］，此后研究發(fā)現KL-6可以作為ILD血清標志物［11］，那么其在CTD-ILD中表達如何，目前相關研究較少。

本研究結果顯示，CTD-ILD組血清KL-6水平高于對照組，與既往研究報道結果類似［9］，這提示KL-6可作為診斷CTD-ILD的血清學指標之一。在肺部結節(jié)病患者中，MUC1 rs4072037基因型影響血清KL-6水平，攜帶G等位基因的患者血清KL-6水平較高、G純合子水平最高、A純合子最低及雜合子中等水平表達，這可能與基因劑量效應相關［11］。那么在CTD-ILD患者中MUC1 rs4072037基因多態(tài)性對KL-6的影響又是怎么樣的呢？雖然本研究也發(fā)現MUC1 rs4072037基因型與血清KL-6水平相關，但不同的是，A/A基因型CTD-ILD患者血清KL-6水平高于A/G基因型，但在對照組中無差異。出現上述不同結果，可能是因為疾病診斷、病情嚴重程度、治療方案、存在合并癥及研究病例樣本量不同等因素所致。血清LDH水平能反應機體急性病變期細胞膜的完整性，在炎癥、腫瘤、過敏及自身免疫性疾病中LDH均可明顯升高，但其特異性較低［12］。本研究中CTD-ILD組血清LDH與KL-6水平均高于對照組，且CTD-ILD組及對照組不同基因型血清LDH水平的比較結果與KL-6類似，提示KL-6在一定程度上也可以反應機體炎癥狀況。

另外，通過進一步分析MUC1 rs4072037基因頻率，發(fā)現其基因型在對照組中的分布類似于CEU數據庫（來自歐洲居民）的分布，這些數據已在HapMap數據庫（國際HapMap項目）中報告（http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en［accessed 26.04.2012］.）， 而 CTDILD患者MUC1 rs4072037的基因型分布明顯不同，A/G基因型頻率最高，同時未觀察到G/G基因型，這提示rs4072037 A等位基因可能與CTD-ILD易感性之間存在相關性，且G/G基因型可用于鑒別診斷CTD-ILD。

最后，研究表明MUC1是一種細胞外蛋白，錨定在上皮表面，參與形態(tài)發(fā)生的信號轉導［2］。rs4072037 SNP破壞了MUC1的生理功能，這是由于rs4072037控制的外顯子2的59區(qū)域的可變剪接，并最終導致人體組織的生理保護失敗［13］。研究報道rs4072037中的A等位基因促進疾病進展，G等位基因對炎癥、癌癥和纖維化具有保護作用［14］。本研究發(fā)現CTD-ILD患者攜帶MUC1 A等位基因比攜帶G等位基因的血清KL-6水平高，但G等位基因與較好的肺功能相關，與既往研究結果一致［15］。同時本研究發(fā)現MUC1 rs4072037 G傾向于與緩解相關（HR=2.16），進一步通過多因素分析發(fā)現，MUC1 rs4072037 G提示疾病緩解可能性大（HR=5.43），C統(tǒng)計表示當rs4072037 G在具有協(xié)變量的模型中時，可以用于預測臨床緩解情況。基于這些結果，提示MUC1 SNP（G）可作為CTD-ILD患者臨床常規(guī)遺傳生物標志物，但本研究樣本量相對較小，因此在CTD-ILD患者中需要更大樣本的隊列研究來驗證。

綜上所述，MUC1 rs4072037基因型與血清KL-6水平、肺功能障礙的嚴重程度和疾病預后相關，可作為評價CTD-ILD疾病嚴重程度及治療效果的指標，但其與肺部纖維化改變之間的因果關系及具體的發(fā)病機制還需進一步研究。

作者貢獻：龍小平進行文章的構思與設計，結果的分析與解釋、撰寫論文；謝立虎進行研究的實施與可行性分析，對文章整體負責，監(jiān)督管理；許麗慧進行數據收集；唐艷華進行數據整理、統(tǒng)計學處理；王衛(wèi)忠進行論文的修訂；李建民負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。