液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)牛奶中金剛烷胺的藥物殘留

張秀妍 葛祥武 王 駿 大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心（遼寧，大連，116023）王慧龍 大連理工大學(xué)（遼寧，大連，116023）

金剛烷胺是金剛烷的衍生物， 屬于三環(huán)胺類，是人用抗病毒藥物，許多國(guó)家在家禽畜牧業(yè)生產(chǎn)中已明確禁止使用金剛烷胺，但仍然存在非法使用的情況［1］，我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第560 號(hào)《獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄》規(guī)定，金剛烷胺不得檢出。

目前，對(duì)金剛烷胺的檢測(cè)較多，但多集中于雞肉、雞蛋等畜產(chǎn)品，對(duì)牛奶中金剛烷胺檢測(cè)的研究較少，本論文對(duì)牛奶中金剛烷胺的檢測(cè)方法進(jìn)行建立、優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 樣品采集及準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)中用到的牛奶為生鮮乳， 采自養(yǎng)殖場(chǎng)，冷凍備用。

1.2 儀器設(shè)備

I-Class 高效液相色譜（美國(guó)Waters 公司）；TQS 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司，配有電噴霧ESI 源）；超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；冷凍離心機(jī)（日本HITACHI 公司）；氮吹儀；渦旋振蕩器；固相萃取裝置；電子天平等。

1.3 藥品與試劑

金剛烷胺溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000μg/mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）、金剛烷胺-D15 溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（10μg/mL，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心）。

Bond Elut C18 小柱 （Agilent，100mg/3mL）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；冰乙酸（優(yōu)級(jí)純，天津凱信化學(xué)工業(yè)有限公司）；磷酸二氫鉀（優(yōu)級(jí)純，天津科密歐公司）；甲酸（優(yōu)級(jí)純，Thermo 試劑）等。

0.1%的甲酸乙腈溶液：取1mL 甲酸用乙腈定容至1L；

0.1%的甲酸水溶液：取1mL 甲酸用超純水稀釋至1L；

1.8%的三氯乙酸乙腈水溶液：稱取20g 三氯乙酸溶于10%的乙腈水溶液中；

磷酸鹽緩沖溶液0.1mol/L：稱取13.6g 磷酸二氫鉀，用水定容至1L，用10.0mol/L 的氫氧化鈉調(diào)PH至6.9-7.1 。

1%的冰乙酸乙腈溶液：取10mL 冰乙酸用乙腈稀釋至1L。

1.4 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

移取金剛烷胺溶液0.1mL 用乙腈定容至100mL， 配成濃度為1.0μg/mL 的混合外標(biāo)中間溶液，用乙腈稀釋成100ng/mL 外標(biāo)混合使用溶液。 移取金剛烷胺-D15 溶液1mL，用乙腈定容至100mL，配成100ng/mL 內(nèi)標(biāo)使用溶液。

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取

準(zhǔn)確稱取牛奶2.0g，置于50mL 塑料離心管中，加入0.1mL 內(nèi)標(biāo)使用溶液， 震蕩混勻； 加入10mL 1%的冰乙酸乙腈溶液， 以2 000rpm 的速度渦旋振蕩1min，4℃，9 000rpm 離心10 分鐘，上清液移入另一離心管中。 再加入10mL 1%的冰乙酸乙腈溶液，重復(fù)提取一次， 離心后合并上清液，45℃氮?dú)獯蹈?，加?.5mL 磷酸鹽緩沖液，渦旋振蕩，待凈化。

1.5.2 凈化

C18 小柱依次經(jīng)2.5mL 乙腈、2.5mL 磷酸鹽緩沖液活化后， 將1.5.1 的提取液過(guò)柱， 待自然流干后，用2.5mL 超純水洗柱，加壓擠干。用1mL 0.1%的甲酸乙腈水溶液（3∶7）洗脫，收集洗脫液，過(guò)0.2μm有機(jī)系濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.6 儀器條件

色譜條件：Waters BEH C18 反相色譜柱（2.1mm×100mm，粒度1.7μm）；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為2μL； 流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液（8：92，V/V）；流速為0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式；去溶劑氣溫度：500℃；霧化氣、干燥氣為高純氮?dú)?，氣體流量為800L/Hr；碰撞氣為氬氣，輸出壓力為0.07MPa；離子模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子（Parent ion）、子離子（Product ion）、碰撞能量（CE）和錐孔電壓（CV）質(zhì)譜參數(shù)。 （見(jiàn)表1）。

表1 金剛烷胺和氟喹諾酮類藥物質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 提取試劑的確定

測(cè)定牛奶的基質(zhì)干擾物主要為脂肪和蛋白質(zhì)，為了提高檢測(cè)靈敏度，降低基質(zhì)干擾，需要將樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬艋蜐饪s。 因金剛烷胺在乙腈中的溶解性較好，且乙腈有沉淀蛋白的作用，同時(shí)對(duì)樣品中脂肪的提取率比較低， 故選擇乙腈為提取溶劑。在商檢標(biāo)準(zhǔn)SN/T4253-2015 中［2］，用三氯乙酸乙腈水溶液提取金剛烷胺等抗病毒類藥物，本論文綜合考察乙腈、1%的甲酸乙腈溶液、1.8%的三氯乙酸乙腈水溶液、2%的冰乙酸乙腈溶液的提取效果， 三氟乙酸的乙腈水溶液和1%的甲酸乙腈溶液， 提取效果均較好，但考慮到三氟乙酸處理不徹底會(huì)造成質(zhì)譜的損害［3］，本論文選用1%的甲酸乙腈溶液為牛奶中金剛烷胺的提取溶液。

2.2 固相萃取小柱的確定

在研究牛奶中金剛烷胺的檢測(cè)方法時(shí)，仲伶俐等人采用HLB 小柱，對(duì)磷脂和蛋白具有很好去除作用。 趙靜等人在對(duì)牛奶和奶粉中維吉尼霉素殘留量的測(cè)定中，采用C18 小柱對(duì)牛奶進(jìn)行凈化［4］，商檢標(biāo)準(zhǔn)SN/T4253-2015 中，用混合陽(yáng)離子交換固相萃取小柱凈化， 在比較了這三種小柱的凈化洗脫效果后，本論文選用具有高鍵合度、低流失、高回收率、選擇性廣、對(duì)金剛烷胺凈化洗脫效果好、回收率較高的C18 小柱。

2.3 工作曲線的繪制

稱取5 份牛奶空白樣品，每份2g，分別置于50mL離心管中，加入金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，處理后上機(jī)的濃度梯度依次為0.5、1.0、2.0、5.0 和10.0 ng·mL-1，其中同位素內(nèi)標(biāo)的含量為10.0 ng·mL-1。 金剛烷胺以金剛烷胺-D15 為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量計(jì)算。 按照1.5 進(jìn)行樣品前處理、1.6 儀器條件上機(jī)檢測(cè)，數(shù)據(jù)處理選用內(nèi)標(biāo)法，工作曲線方程為y=1.03017x-0.03579，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999631， 其中y 為外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，x 為外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)濃度的比值，結(jié)果表明，金剛烷胺在1.0μg·kg-1～10μg·kg-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 方法的定量限

采用空白樣品添加低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5、1.6 進(jìn)行測(cè)定，以信噪比S/N≥10 確定金剛烷胺的定量限，為1.0μg·kg-1［5-6］，滿足金剛烷胺藥物殘留的檢測(cè)要求。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

本方法的準(zhǔn)確度通過(guò)測(cè)定加標(biāo)樣品的平均回收率來(lái)確定，精密度通過(guò)計(jì)算平均回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)確定。 在稱樣量為2g，加標(biāo)樣品的添加濃度分別為1、2、10μg·kg-1、每個(gè)添加濃度做6 個(gè)平行樣品，按1.5、1.6 進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)［7］，平均回收率在80%～112%之間， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%， 說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和較好的精密度，滿足牛奶中金剛烷胺藥物殘留的檢測(cè)要求。 添加濃度為2μg·kg-1的加標(biāo)樣品測(cè)得的質(zhì)譜圖，保留時(shí)間為145min。 （見(jiàn)圖1）。

圖1 金剛烷胺和氘代金剛烷胺加標(biāo)溶液質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了牛奶中金剛烷胺的檢測(cè)方法，定量限為1.0μg·kg-1， 線性范圍為0.5ng·mL-1～10ng·mL-1，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，重復(fù)性較好，滿足牛奶中金剛烷胺的檢測(cè)要求。