NaHS對(duì)菘藍(lán)吲哚生物堿合成途徑中相關(guān)基因表達(dá)的影響

賈紅磊，劉嵐鈺，劉華欣

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

菘藍(lán)是常用中藥板藍(lán)根與大青葉的主要來源植物，靛藍(lán)、靛玉紅是同屬于雙吲哚生物堿類的活性物質(zhì)，二者互為同分異構(gòu)體.藥理研究表明其具有抗微生物、提高免疫力 、抗炎、抗病毒和解熱等多種作用[1].21世紀(jì)以來，對(duì)于菘藍(lán)代謝相關(guān)通路，與關(guān)鍵性信號(hào)分析有所研究，有關(guān)次生代謝物研究較少.目前，廣泛認(rèn)定的靛藍(lán)、靛玉紅是菘藍(lán)體內(nèi)起主要藥效作用的次生代謝物成分[2]，其中主要萜類部分的合成主要依賴于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸(MVA)途徑和質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑，其中MVA途徑存在于各類高等植物中，莽草酸在莽草酸激酶(Shikimate kinase，SK)、鄰氨基苯甲酸合酶(Anthranilate synthase，AS)等酶的一系列作用下生成合成吲哚[3,4].BcSK是編碼SK的基因，SK在大腸桿菌和酵母菌中研究頗多[5,6].AS分為鄰氨基苯甲酸合酶亞基合酶(Anthranilate Synthaseαsubunit，ASA)，鄰氨基苯甲酸合酶亞基合酶(Anthranilate Synthase subunit，ASB)，其中，ASA可將分支酸催化為鄰氨基苯甲酸，ASB將谷氨酰胺催化裂解為游離銨根離子并將銨根離子傳遞給亞基，這其中BcASA1，BcASA2，BcASB是編碼ASA和ASB的基因，進(jìn)一步發(fā)生催化作用經(jīng)MVA途徑生成吲哚[7].脫氧木酮糖-5-磷酸還原酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR)是MEP途徑上的關(guān)鍵酶，BcDXR是編碼DXR的基因，DXR首先在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)，是目前藥用植物的研究熱點(diǎn)[8].

H2S在動(dòng)植物體內(nèi)是廣泛存在，植物中H2S的產(chǎn)生主要是由d-半胱氨酸脫巰基酶 (d-cysteine desulfhydrase,DCD) 和LCD催化半胱氨酸分解產(chǎn)生的[9,10]，近期也有越來越多的研究表明了H2S在動(dòng)植物體內(nèi)可作為第二信使，能夠改善植物葉片光合作用，并用來調(diào)節(jié)植物對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答[11-14].其H2S信號(hào)分子在植物生理過程中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用，參與著調(diào)控植物多種生理過程.Lin等[15]研究結(jié)果表明，H2S供體NaHS可以誘導(dǎo)黃瓜幼苗不定根的產(chǎn)生.Fang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，NaHS處理番茄幼苗可提高其根系中硫化氫合成酶活性和內(nèi)源H2S的含量.所以運(yùn)用NaHS處理植物可以進(jìn)一步分析菘藍(lán)耐藥基因相關(guān)表達(dá)量變化，創(chuàng)新性的從分子學(xué)角度定量分析也是具有一定研究意義的.

因此,本文利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)菘藍(lán)葉子和根中BcSK、BcDXR、BcASA1、BcASA2、BcASB的相對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行分析，探究NaHS與空白組CK處理下對(duì)菘藍(lán)幼苗體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用以及合成前體MEP和MVA途徑上相關(guān)酶合成基因表達(dá)的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 植物培養(yǎng)

本文所用的菘藍(lán)幼苗均采用水培方式進(jìn)行培養(yǎng)，一般研究中氮硫元素的配施對(duì)于植物中靛藍(lán)和靛玉紅的含量大致呈現(xiàn)為高低硫抑制,適宜硫濃度促進(jìn)的趨勢(shì)[17]，H2S外源供體是NaHS，由賈紅磊等[18]研究可知在150μmol/L NaHS處理組下的菘藍(lán)幼苗植株高度有顯著性上升，可以緩解Cd脅迫導(dǎo)致的幼苗植株生長(zhǎng)抑制作用，所以本實(shí)驗(yàn)處理組濃度設(shè)定為150μmol/L ，在經(jīng)過NaHS處理和空白對(duì)照ck組處理后后，分別收集處理3 h、6 h、9 h時(shí)菘藍(lán)幼苗葉子及根，收樣后經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱備用.

1.2 幼苗組織總RNA提取

幼苗葉子和根中總RNA的提取采用北京聚合美生物科技公司的植物通用RNA快速提取盒.樣品cDNA的合成采用北京聚合美生物科技公司的M5 First Strand cDNA Synthesis kit試劑盒，2μg總RNA建立50μL體系，程序設(shè)置為45 ℃，15 min，85 ℃，15 min，反應(yīng)后即為cDNA樣品，將cDNA樣品置于-20 ℃冰箱保存.

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析

選擇菘藍(lán)Actin基因作為內(nèi)參基因，以菘藍(lán)總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板，并進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增.通過相關(guān)文獻(xiàn)獲得靛藍(lán)和靛玉紅合成前體吲哚合成途徑上的關(guān)鍵酶SK、DXR、AS的引物序列[19,20].其中所用內(nèi)參及目的基因引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1所示.程序設(shè)定如下：(95 ℃,60 s)for 1 cycle;(95 ℃,15 s;48 ℃,15 s;72 ℃,30 s) for 40 cycle.每個(gè)cDNA樣品重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，使用2-ΔΔCt方法[21]計(jì)算相對(duì)表達(dá)值.

表1 Real-time RT-qPCR引物

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)的分析方法，探究菘藍(lán)幼苗的不同藥效基因BcSK、BcDXR、BcASA1、BcASA2、BcASB皆受到外源信號(hào)分子NaHS的調(diào)控，對(duì)吲哚生物堿合成途徑中的關(guān)鍵基因進(jìn)行定量分析，將會(huì)更清晰理解藥效物質(zhì)的合成途徑并奠定基礎(chǔ)，由此來推測(cè)吲哚類生物堿次生代謝過程以及調(diào)控的變化量，本實(shí)驗(yàn)在菘藍(lán)幼苗中的各基因的相對(duì)表達(dá)情況運(yùn)用SPSS17.0軟件進(jìn)行顯著性分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為三次實(shí)驗(yàn)均值.

2.1 BcSK在菘藍(lán)幼苗中的表達(dá)情況

SK是莽草酸途徑上第五步的反應(yīng)催化酶，也是莽草酸途徑中第一個(gè)關(guān)鍵酶.BcSK基因在菘藍(lán)幼苗葉片和根部中的表情況如圖1所示.與對(duì)照CK組相比，在150μmol/L NaHS處理下，BcSK基因的相對(duì)表達(dá)量在3 h和9 h出現(xiàn)明顯上調(diào)，在3 h時(shí)BcSK相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)峰值，在6 h時(shí)BcSK基因的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)明顯下調(diào).其中3 h處理下葉片中BcSK基因的相對(duì)表達(dá)量顯著性上調(diào)了1094.1%，根中BcSK基因的相對(duì)表達(dá)量顯著性地上調(diào)了228.4%.150 μmol/L NaHS處理9 h時(shí)，葉片中BcSK基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)了230.9%，根中BcSK基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)了95.3%.由于在6 h時(shí)BcSK基因的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)明顯下調(diào)，其中葉片中BcSK基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了83.9%，而根部的BcSK基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了31.2%.根據(jù)以上結(jié)果顯示，不同時(shí)間NaHS處理對(duì)于BcSK基因在菘藍(lán)幼體內(nèi)相對(duì)表達(dá)量的影響是有差別的.

(a)NaHS處理對(duì)菘藍(lán)幼苗中BcSK基因在葉片中表達(dá)情況的影響

(b)NaHS處理對(duì)菘藍(lán)幼苗中BcSK基因在根中表達(dá)情況的影響圖1 NaHS處理對(duì)菘藍(lán)幼苗中BcSK基因表達(dá)情況的影響

2.2 BcDXR在菘藍(lán)幼苗中的表達(dá)情況

DXR作為合成吲哚類生物堿萜類部分MEP途徑上第一個(gè)關(guān)節(jié)酶，對(duì)調(diào)節(jié)吲哚類生物堿的合成有著重要的作用.BcDXR基因在菘藍(lán)幼苗葉片和根中的表達(dá)情況如圖2所示.與對(duì)照CK組相比，150μmol/L NaHS處理下，BcDXR基因的相對(duì)表達(dá)量在3 h處理情況下葉片中BcDXR基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)了1 789.9%，根中上調(diào)了307.0%，在9 h處理?xiàng)l件下，葉片中BcDXR基因的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)了51.1%，而根中上調(diào)了161.5%.然而，在6 h時(shí) NaHS處理下，葉片中BcDXR基因的相對(duì)表達(dá)量是上調(diào)了50.3%，而在根部地下部分BcDXR基因的相對(duì)表達(dá)量是下調(diào)了15.32%.由以上結(jié)果可得短時(shí)間內(nèi)BcDXR基因的相對(duì)表達(dá)量在根與葉片中主要表現(xiàn)為上調(diào)作用，而在6 h處理下葉片與根分別表現(xiàn)出了上調(diào)和下調(diào)不同作用.

(a)NaHS處理對(duì)菘藍(lán)幼苗中BcDXR基因在葉片中表達(dá)情況的影響

(b)NaHS處理對(duì)菘藍(lán)幼苗中BcDXR基因在根中表達(dá)情況的影響圖2 NaHS處理對(duì)菘藍(lán)幼苗中BcDXR基因表達(dá)情況的影響

2.3 BcASA1在菘藍(lán)幼苗中的表達(dá)情況

ASA是編碼鄰氨基苯甲酸合酶亞基的基因，本篇選取關(guān)鍵基因BcASA1和BcASA2來進(jìn)行相對(duì)熒光定量分析.其中BcASA1基因在菘藍(lán)幼苗葉片和根部中的表達(dá)情況如圖3所示.與CK處理組相比，在150μmol/L NaHS對(duì)BcASA1基因的相對(duì)表達(dá)量在不同處理時(shí)間表現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)作用.在3 h時(shí)NaHS處理下的葉片中BcASA1基因的相對(duì)表達(dá)量是顯著上調(diào)了276.3%，而在根部BcASA1基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了24.8%，在6 h葉片中BcASA1基因的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)了14%，而在根部BcASA1基因的相對(duì)表達(dá)量是下調(diào)了26.8%，在9 h葉片中BcASA1基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了20.9%，在根部BcASA1基因的相對(duì)表達(dá)量則上調(diào)了173.3%.對(duì)于BcASA1基因來說，其在NaHS處理下不同時(shí)間段的葉片和根部BcASA1基因的相對(duì)表達(dá)含量趨勢(shì)是大不相同的，3 h和6 h時(shí)在葉片表現(xiàn)為上調(diào)，在根部均表現(xiàn)為下調(diào).但在9 h時(shí)葉片中的BcASA1基因的相對(duì)表達(dá)量是顯著上調(diào)的.

(a)NaHS處理對(duì)菘藍(lán)幼苗中BcASA1基因在葉片中表達(dá)情況的影響

2.4 BcASA2在菘藍(lán)幼苗中的表達(dá)情況

BcASA2基因在菘藍(lán)幼苗葉片和根部中的表達(dá)情況如圖4所示.與CK處理組相比，在150μmol/L NaHS處理下，葉片與根中BcASA2基因的相對(duì)表達(dá)量在3 h都出現(xiàn)了明顯上調(diào)，而在6 h時(shí)表現(xiàn)出明顯下調(diào)，在9 h處理時(shí)葉片與根分別表現(xiàn)出不同的趨勢(shì).其中，3 h時(shí)150μmol/L NaHS處理下葉片中的BcASA2基因的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)了252.3%，根部相對(duì)表達(dá)量上調(diào)了141.0%；在6 h時(shí)葉片當(dāng)中的BcASA2基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了82.0%，而在根部其相對(duì)表達(dá)量并無顯著變化，在9 h時(shí)葉片中的BcASA2基因的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)了47.2%，而在根部其相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了59.5%.以上結(jié)果分析可知，較短時(shí)間處理下，葉片和根當(dāng)中BcASA2基因的相對(duì)表達(dá)量均表現(xiàn)為明顯上調(diào)，但長(zhǎng)時(shí)間的處理下該基因的相對(duì)表達(dá)情況不一致.

(a)NaHS處理對(duì)菘藍(lán)幼苗中BcASA2基因在葉片中表達(dá)情況的影響

2.5 BcASB在菘藍(lán)幼苗中的表達(dá)情況

ASB是編碼鄰氨基苯甲酸合酶亞基的基因.BcASB基因在菘藍(lán)幼苗葉片和根部中的表情況如圖5所示.與對(duì)照組相比，150μmol/L NaHS處理下，葉片中BcASB基因的相對(duì)表達(dá)量在3 h、6 h、9 h的不同時(shí)間均出現(xiàn)下調(diào)，而根中BcASB基因的相對(duì)表達(dá)量在3 h、9 h時(shí)出現(xiàn)上調(diào)，6 h時(shí)出現(xiàn)下調(diào).其中3 h時(shí)，NaHS處理下葉片當(dāng)中的BcASB基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)了70.9%，而在根部當(dāng)中BcASB基因的相對(duì)表達(dá)量是上調(diào)了16.9%的；6 h時(shí)NaHS處理下葉片中BcASB基因無明顯變化，根部的BcASB基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)了41.3%；9 h時(shí)處理下葉片當(dāng)中的BcASB基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)了38.2%，在根部中的BcASB基因的相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)了84.2%.上述分析結(jié)果可知，在NaHS處理下葉片中的BcASB基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，長(zhǎng)時(shí)間的處理下顯著上調(diào)根中BcASB基因的相對(duì)表達(dá)量.

(a)NaHS處理對(duì)菘藍(lán)幼苗中BcASB基因在葉片中表達(dá)情況的影響

3 結(jié)論

本文主要對(duì)菘藍(lán)幼苗葉片和根中BcSK、BcDXR、BcASA1、BcASA2、BcASB基因進(jìn)行相對(duì)熒光定量分析.經(jīng)過不同時(shí)間NaHS處理后，BcSK、BcDXR、BcASA1、BcASA2、BcASB基因會(huì)表現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)作用.其中在3 h處理下，這五種基因在菘藍(lán)的葉片和根中大都表現(xiàn)出顯著上調(diào)作用；在6 h處理下，BcSK基因的相對(duì)表達(dá)量在葉片和根均表現(xiàn)下調(diào)作用，而BcDXR基因的相對(duì)表達(dá)量在6 h時(shí)的葉片與根會(huì)表現(xiàn)出上調(diào)和下調(diào)的不同作用；在9 h時(shí)，葉片中的BcASA1基因和根中BcASB基因的相對(duì)表達(dá)量均是顯著上調(diào)的，而不同時(shí)間處理的葉片中的BcASB基因的相對(duì)表達(dá)量均表現(xiàn)下調(diào)作用.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NaHS以S2-形式的硫素在菘藍(lán)幼苗的相關(guān)藥效成分合成途徑中能夠起到非常重要的調(diào)控作用.

大多數(shù)學(xué)者的研究[22-24]多集中在植物次生代謝產(chǎn)物靛藍(lán)和靛玉紅的含量測(cè)定，國(guó)外有研究[25-27]菘藍(lán)根部基因表達(dá)的RT-qPCR以及如何獲得參與活性成分生物合成的候選基因.而本文在NaHS處理下使植物中的硫元素資源更多轉(zhuǎn)向了次生代謝方向，這也是菘藍(lán)對(duì)不利環(huán)境的一種適應(yīng)機(jī)制.

因此，利用NaHS來處理可能會(huì)誘導(dǎo)菘藍(lán)體內(nèi)相關(guān)基因的合成，從而提高靛藍(lán)和靛玉紅的含量，以促進(jìn)相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成.已有報(bào)道證明BcASA1、BcASA2、BcASB等相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)對(duì)靛藍(lán)、靛玉紅等關(guān)鍵物質(zhì)的含量具有正相關(guān)的影響[20]，一方面硫元素作為酶反應(yīng)中心的重要元素,它的含量可以調(diào)節(jié)吲哚類生物堿合成相關(guān)酶的活性[28]，另一方面氮硫配施對(duì)菘藍(lán)的靛藍(lán)、靛玉紅合成含量具有極顯著的影響(P<0.05)[29]，會(huì)隨著硫素濃度的增加呈先上升后下降趨勢(shì)，也更有利的說明NaHS處理可能激發(fā)次生代謝，從而影響靛藍(lán)、靛玉紅的含量積累.