親子鑒定中Penta E基因座等位基因丟失1例

（1.浙江迪安鑒定科學(xué)研究院 浙江迪安司法鑒定中心，浙江 杭州 310007；2.中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所，北京 100000；3.甘肅迪安同享醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心司法鑒定所，甘肅 蘭州 730000）

1 案 例

1.1 簡(jiǎn)要案情

因需要辦理孩子出生醫(yī)學(xué)證明，父親要求與孩子進(jìn)行親子鑒定。本中心分別采取了父親與孩子的指尖末梢血作為本次鑒定的檢材。

1.2 檢驗(yàn)方法

采用Chelex-100法[1]提取檢材DNA，先后采用MicroreaderTM21（Direct）ID System試劑盒（北京閱微基因技術(shù)有限公司，以下簡(jiǎn)稱“MR21試劑盒”）、Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A[基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司，以下簡(jiǎn)稱“20A試劑盒”]及AGCU Expressmarker 20熒光檢測(cè)試劑盒（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司，以下簡(jiǎn)稱“EX20試劑盒”）進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用3100基因分析儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用GeneMapper?IDv3.2軟件分析各基因座的基因型，采用QIAamp DNA Investigator試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）提取純化檢材DNA并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序分析，實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照相關(guān)操作手冊(cè)進(jìn)行。

1.3 檢驗(yàn)結(jié)果

1.3.1 常染色體STR基因分型結(jié)果

父親和孩子的DNA經(jīng)MR21試劑盒和20A試劑盒檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，在Penta E基因座，父親基因分型為“15”純合子，孩子基因分型為“20”純合子，不符合孟德爾遺傳規(guī)律，其余19個(gè)STR基因座均符合孟德爾遺傳規(guī)律。經(jīng)EX20試劑盒復(fù)核檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，在Penta E基因座，父親基因分型為“11，15”雜合子，孩子基因分型為“11，20”雜合子，符合孟德爾遺傳規(guī)律。MR21、20A、EX20試劑盒檢測(cè)Penta E基因座相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1～3。

1.3.2 測(cè)序結(jié)果

為了明確Penta E基因座的分型結(jié)果，對(duì)父親和孩子的等位基因片段進(jìn)行克隆測(cè)序分析，結(jié)果如表1所示，父親和孩子在Penta E基因座均檢出了11個(gè)AAAGA核心重復(fù)單位。

圖1 MR21試劑盒檢測(cè)分型圖譜（Penta E基因座）Fig.1 Detection and typing map of MR21 kit（Penta E locus）

圖2 20A試劑盒檢測(cè)分型圖譜（Penta E基因座）Fig.2 Detection and typing map of 20A kit（Penta E locus）

圖3 EX20試劑盒檢測(cè)分型圖譜（Penta E基因座）Fig.3 Detection and typing map of EX20 kit（Penta E locus）

表1 父親和孩子Penta E基因座測(cè)序所得重復(fù)序列Tab.1 Repeat sequence of Penta E locus from father and child

1.4 鑒定意見(jiàn)

結(jié)合常染色體STR基因分型結(jié)果及測(cè)序結(jié)果，支持父親與孩子之間存在親生血緣關(guān)系。

2 討 論

在法醫(yī)物證學(xué)親子鑒定中，短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）基因座分型結(jié)果不符合孟德爾遺傳規(guī)律的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。一般認(rèn)為是滑動(dòng)鏈錯(cuò)配（slipped-strand mispairing，SSM），即染色體DNA復(fù)制滑動(dòng)形成的一種遺傳變異形式。據(jù)統(tǒng)計(jì)[2-3]，大多數(shù)STR基因座的突變只涉及單個(gè)重復(fù)單位的增加或減少，即一步突變（one step mutation），約占突變等位基因的90%，兩個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單位的改變少見(jiàn)。有學(xué)者[4]提出了STR的逐步突變模式（stepwise mutation model，SMM），即多步突變是通過(guò)逐步突變形成的。

本案例使用MR21和20A試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在Penta E基因座，父親的基因分型為“15”，孩子的基因分型為“20”，父親不能提供給孩子必需的等位基因20，不符合孟德爾遺傳規(guī)律。兩個(gè)等位基因間相差5個(gè)重復(fù)單位，參照《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》（GB/T 37223—2018）中不符合遺傳規(guī)律發(fā)生率的計(jì)算方法，5步突變的發(fā)生率應(yīng)為2.0×10-7，發(fā)生可能性很低。觀察父親在該基因座等位基因“15”峰面積值與相鄰純合基因座等位基因峰面積值的一半相當(dāng)，孩子在該基因座等位基因“20”峰面積值與相鄰雜合基因座單個(gè)等位基因峰面積值相當(dāng)。因此考慮該基因座存在等位基因丟失的可能。經(jīng)EX20試劑盒復(fù)核檢測(cè)，父親的基因型為“11，15”，孩子的基因型為“11，20”，證實(shí)為等位基因丟失。

等位基因丟失，亦稱雜合性丟失[5]。在使用STR試劑盒檢測(cè)時(shí)，由于模板DNA在引物結(jié)合處的3′端附近存在DNA多態(tài)性、堿基的插入/缺失，PCR擴(kuò)增中相應(yīng)引物無(wú)法退火[6]，可能會(huì)出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象。根據(jù)基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司提供的相關(guān)試劑盒引物序列，與本案例測(cè)序結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)DNA模板在20A試劑盒的下游引物結(jié)合區(qū)域出現(xiàn)了堿基轉(zhuǎn)換（表1），即鳥嘌呤（G）轉(zhuǎn)換成了腺嘌呤（A）。PCR擴(kuò)增中等位基因11的丟失可能與此處引物無(wú)法退火有關(guān)。

STR檢驗(yàn)中，當(dāng)出現(xiàn)親權(quán)鑒定兩樣本間個(gè)別基因座分型不相同或不符合孟德爾遺傳規(guī)律時(shí)，特別是分型結(jié)果為純合子時(shí)，可采用不同引物設(shè)計(jì)（擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度差別盡量大）的兩種檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)，以避開DNA多態(tài)性位點(diǎn)，避免等位基因丟失，必要時(shí)通過(guò)測(cè)序確定序列，得到準(zhǔn)確分型，使結(jié)論更嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)。