超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定蒲公英根和蒲公英葉中4種指標(biāo)性成分的含量*

王超眾，王萌萌，魏強(qiáng)，邵丙俠，陳爽，張曉雪，董巍，孫輯凱

(1.齊齊哈爾市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，黑龍江齊齊哈爾 161005；2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161005；3.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030604；4.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，齊齊哈爾 161006)

蒲公英為菊科植物蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz)、堿地蒲公英(TaraxacumborealisinenseKitam.)或同屬數(shù)種植物的干燥全草，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋的功效[1]。蒲公英具有良好的廣譜抗菌、抗自由基、抗病毒、抗感染、抗腫瘤作用[2]，臨床上主要用于治療慢性胃炎、胃潰瘍、急性乳腺炎、盆腔炎、陰道炎、急性化膿性感染和泌尿系統(tǒng)炎癥等疾病[3]。蒲公英中化學(xué)成分種類非常多，主要為黃酮類、苷類、萜類、甾醇類、酚類、有機(jī)酸等[4]。蒲公英中酚酸類化合物含量豐富，尤其是咖啡酸含量較高，也是抗菌的主要成分[5]，《中華人民共和國藥典》(2015年版)采用高效液相色譜法測定其咖啡酸的含量，咖啡酸在葉、花、根中均有分布，但在根中含量明顯減少[6]，葉中咖啡酸的含量為根中4～6倍[7]。蒲公英主要活性成分不僅是酚酸類，還包括黃酮類[8]，而黃酮以木犀草素及其糖苷含量較高，而目前對于蒲公英根、蒲公英葉中黃酮類成分的含量差異報(bào)道較少，并且液質(zhì)聯(lián)用法已成為檢測中藥成分的主要方法[9-10]，故筆者在本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法同時(shí)測定蒲公英根、蒲公英葉中對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷4種成分含量，為進(jìn)一步研究蒲公英根和葉兩部位所含化學(xué)成分的差別及改進(jìn)臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1儀器 1290 infinity II型超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；TSQ Quantum Access型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司)；Sartorius BP121S電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，感量：0.01 mg)；CQ-250超聲波清洗器(上海必能信有限公司)；DFY-400高速萬能粉碎機(jī)(上海比朗儀器有限公司)。

1.2材料 對香豆酸對照品(批號(hào)：MUST-18050603)、木犀草苷對照品(批號(hào)：MUST-17121210)購于成都曼思特生物科技有限公司；咖啡酸對照品(批號(hào)：110885-201703)、木犀草素對照品(批號(hào)：111520-201605)購于中國食品藥品檢定研究院，含量均≥99.6%；乙腈(色譜純，天津Dikma)；甲酸(色譜純，天津Dikma)；水為超純水；其余試劑均為分析純。蒲公英樣品經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院孫輯凱副教授鑒定分別為東北蒲公英(TaraxacumohwianumKitam)、紅梗蒲公英(TaraxacumerythopodiumKitag)、白緣蒲公英(TaraxacumplatypecidumDiels)、戟片蒲公英(TaraxacumasiaticumDahl.)的全草，紅梗蒲公英采集于內(nèi)蒙古莫力達(dá)瓦旗多熱博熱其勒村，其余品種采集于黑龍江省齊齊哈爾市。

2 方法與結(jié)果

2.1混合對照品溶液的制備 分別精密稱取對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷對照品適量，分別置于6個(gè)5 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解后稀釋到刻度，搖勻，用甲醇繼續(xù)稀釋，制得濃度分別為100 μg·mL-1的對照品儲(chǔ)備溶液。分別精密量取對照品儲(chǔ)備溶液2 mL，置同一個(gè)100 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，即得混合對照品溶液。

2.2供試品溶液的制備 精密稱取蒲公英粉末(過二號(hào)篩) 0.5 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲(功率250 W，頻率100 kHz)30 min，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，經(jīng)孔徑0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3色譜條件 色譜柱：Dikma Endeavorsil C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫條件：0～3 min，90% A； 3～7 min，90%→30% A；7～10 min，30% A；10～11 min，30%→90% A；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.4質(zhì)譜條件 ESI離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式，干燥氣溫度370 ℃，鞘氣流量10 Bar，輔助氣流量30 Bar，點(diǎn)噴霧電壓4 000 V，對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷監(jiān)測離子對分別為165.1/119.0，181.1/135.2，287.2/153.2，449.3/287.1。見圖1。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1線性關(guān)系考察 取“2.1”項(xiàng)下對照品儲(chǔ)備液適量，將對照品溶液分別稀釋10，20，50，100，200，1000，10 000倍，得到一系列濃度的對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，經(jīng)孔徑0.22 μm 微孔濾膜濾過后按“2.3”、“2.4”項(xiàng)下條件，進(jìn)樣2 μL。以峰面積積分(Y)對濃度(X)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明各成分在檢測濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見表1。

1.對香豆酸；2.咖啡酸；3.木犀草素；4.木犀草苷。

表1 4種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.2精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按“2.3” “2.4”項(xiàng)條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，結(jié)果對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的峰面積RSD 分別為0.56%，0.77%，0.32%，0.58%，表明儀器精密度良好。

2.5.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批蒲公英樣品，蒲公英根和葉各取6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3” “2.4”項(xiàng)條件進(jìn)樣測定，記錄各成分峰面積，計(jì)算得到蒲公英根中對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的含量RSD分別為 0.38%，0.68%，0.81%，0.50%，蒲公英葉中對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的含量RSD分別為 0.43%，0.37%，0.85%，0.57%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的蒲公英葉供試品溶液各2 μL，分別在配制后 0，2，6，10，16，24 h進(jìn)樣測定，記錄各成分峰面積，計(jì)算得到對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的峰面積RSD分別為0.32%，0.50%，0.44%，0.71%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5檢測限、定量限實(shí)驗(yàn) 將對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液繼續(xù)稀釋，在選定的色譜、質(zhì)譜條件下，按照信噪比3：1計(jì)算，測得對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的檢測限分別為0.4，0.6，0.5，0.5 ng·mL-1；按照信噪比10：1計(jì)算，測得對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷的定量限分別為1.2，1.8，1.5，1.5 ng·mL-1。

2.5.6加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的紅梗蒲公英根約0.25 g；每種各6份，分別加入100 μg·mL-1對照品儲(chǔ)備溶液0.01，0.1，0.02，0.025 mL；再精密稱取已知含量的蒲公英葉約0.25 g，每種樣品各6份，分別加入100 μg·mL-1的對照品儲(chǔ)備溶液0.1，1.5，0.5，0.5 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按“2.3”“2.4”項(xiàng)條件進(jìn)樣測定，計(jì)算得到對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷在蒲公英根和葉中的平均加樣回收率，結(jié)果見表2，表3。

2.6樣品的含量測定 對蒲公英根樣品和蒲公英葉樣品分別進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表4。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS法在15 min內(nèi)同時(shí)測定對香豆酸、咖啡酸、木犀草素、木犀草苷，該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，可用于測定蒲公英根和葉不同部位中4個(gè)指標(biāo)性成分的含量。實(shí)驗(yàn)比較30%，50%，70%甲醇等不同提取溶劑，發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取效果最好。同時(shí)比較回流、超聲提取方法，結(jié)果提取率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，超聲提取簡便快捷，提取率高，故選擇超聲提取。

《中華人民共和國藥典》2015年版一部中蒲公英的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定咖啡酸的含量限度，本研究選取酚酸類活性成分對香豆酸、咖啡酸，黃酮類活性成分木犀草素、木犀草苷為指標(biāo)進(jìn)行含量測定，從而達(dá)到對蒲公英根與蒲公英葉質(zhì)量控制的目的。通過對蒲公英根、葉中的指標(biāo)性成分含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同品種蒲公英葉所含指標(biāo)性含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根，且木犀草素在根中未檢測到，而蒲公英中黃酮的含量以木犀草素含量最高，蒲公英的抗氧化活性就是基于其黃酮成分[11]，有文獻(xiàn)比較野生蒲公英根、葉提取物的抗炎作用，結(jié)果表明葉的抗炎作用優(yōu)于根[12]，本研究含量測定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

表2 蒲公英根中4種成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)

表3 蒲公英葉中4種成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)

續(xù)表3 蒲公英葉中4種化學(xué)成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)

表4 蒲公英根和葉中4種成分含量測定結(jié)果

蒲公英作為藥、食同源的中草藥，開發(fā)利用其資源已引起人們的重視，本研究建立了一種快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、分離度高的含量測定方法，可為蒲公英根、蒲公英葉的含量測定限度提供參考，也為評(píng)價(jià)其藥用價(jià)值及其合理利用蒲公英不同部位提供理論依據(jù)。