PGAM5對(duì)食管癌細(xì)胞系增殖與轉(zhuǎn)移能力的影響

郭秉楠，燕憲亮，許 鐵

食管癌作為消化道系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，由于其高侵襲性和低存活率，5 a生存率僅為10%～15%，其發(fā)生率在人類所有惡性腫瘤中列第八位，死亡率列第六位[1-3]。由于人們的健康意識(shí)以及檢測(cè)條件的限制，大量原發(fā)食管癌患者初診時(shí)已發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[4]。近年來(lái)，隨著對(duì)食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)理的深入研究，越來(lái)越多的治療靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，但是有效且安全的治療靶點(diǎn)對(duì)食管癌的預(yù)后仍不甚理想。因此，尋找參與食管癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物及治療干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)于指導(dǎo)治療、提高患者生存率具有重要的意義。

磷酸甘油酸變位酶/蛋白家族5 (PGAM5,phosphoglycerate mutase/protein family member)是一個(gè)非典型的線粒體絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，與磷酸甘油酸變位酶同源，但缺乏相應(yīng)的酶催化功能，最初發(fā)現(xiàn)與Bcl-xL相互作用[5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，PGAM5調(diào)節(jié)多重細(xì)胞死亡通路，包括凋亡和壞死[6-7]。例如PGAM5與Bcl-xL調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)下的線粒體自噬，從而控制細(xì)胞凋亡。目前關(guān)于PGAM5在腫瘤中的作用研究較少，主要集中于肝癌和彌散性大B淋巴細(xì)胞瘤，均發(fā)現(xiàn)其在腫瘤組織中顯著升高，但在食管癌中的生物學(xué)作用尚不明確[8-9]。本研究通過(guò)小干擾RNA技術(shù)，在體外探討PGAM5對(duì)食管癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移能力的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑人食管上皮細(xì)胞系HEEC及人食管癌細(xì)胞系KYSE150購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；小干擾RNA(PGAM5:5’-AGTCAGAAGGGTTGGCCAA-3’)、對(duì)照小干擾RNA(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3’)購(gòu)自上海吉瑪公司； Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Thermo Fisher公司；抗PGAM5、Bcl-xL 和MMP2抗體購(gòu)自CST公司；β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz；CCK-8購(gòu)自碧云天公司；Annexin V-FITC和PI購(gòu)自Biolegend公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人食管正常上皮細(xì)胞HEEC及食管癌細(xì)胞系KYSE150培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。兩種細(xì)胞系在含5%二氧化碳的37 ℃的培養(yǎng)箱中備用。在轉(zhuǎn)染特異性siRNA及對(duì)照siRNA前一天取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞系各5×105個(gè)細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到60%密度時(shí)，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)取轉(zhuǎn)染后的人食管癌細(xì)胞系KYSE150鋪于96孔培養(yǎng)板中，每空4 000個(gè)細(xì)胞，每孔加完全培養(yǎng)基200 μL后置于含5%二氧化碳的37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d，分別取24、48、72、96 h時(shí)間點(diǎn)棄培養(yǎng)基，加入新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL、CCK8溶液10 μL，充分混勻后加入96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，酶標(biāo)儀測(cè)OD450值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)取1×106轉(zhuǎn)染后的KYSE150細(xì)胞放置于流式管中，500 μL 流式緩沖液(含0.5%FBS的PBS)洗1遍，100 μL流式緩沖液重懸細(xì)胞并加入3 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，輕輕混勻后4 ℃避光孵育30 min，500 μL 流式緩沖液洗2遍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)人食管癌細(xì)胞系KYSE150轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，用200 μL黃色移液器吸頭，利用直尺在6孔板底部劃1條等距離平行線，用PBS輕輕洗去滑落的細(xì)胞，用維持培養(yǎng)基(含1%胎牛血清)在37 ℃的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0、12、24、48 h用電子顯微鏡采集圖像，觀察細(xì)胞遷移情況。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)相對(duì)定量通過(guò)image J軟件進(jìn)行。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)侵襲實(shí)驗(yàn)在Transwell小室上層均勻鋪40 μL含基質(zhì)膠的培養(yǎng)基，置于37 ℃的培養(yǎng)箱備用。每空4 000個(gè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入上室中后加入200 μL培養(yǎng)基，Transwell下層加含15%胎牛血清的培養(yǎng)基800 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，90%甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS漂洗2次，電子顯微鏡采集圖像，觀察細(xì)胞侵襲情況。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)相對(duì)定量通過(guò)image J軟件進(jìn)行。

1.2.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染后的正常人食管上皮細(xì)胞及食管癌癌細(xì)胞系裂解液50 μg于上樣緩沖液中100 ℃煮10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳2 h后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上；一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜后，TBST漂洗3次，每次10 min；二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h后，TBST漂洗3次，每次10 min；化學(xué)發(fā)光(electro chemilamines cence,ECL)儀中進(jìn)行拍照并分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 兩種細(xì)胞系PGAM5的表達(dá)通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與人食管上皮細(xì)胞系HEEC相比，KYSE150細(xì)胞系的PGAM5蛋白的表達(dá)水平顯著高于HEEC細(xì)胞系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)，提示食管癌細(xì)胞中PGAM5蛋白可能異常高表達(dá)。

①P<0.05。

2.2 siRNA干擾食管癌細(xì)胞系后對(duì)PGAM5、Bcl-xL 、MMP2蛋白表達(dá)的影響siPGAM5轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞系KYSE150 48 h后，Western blotting檢測(cè)PGAM5、Bcl-xL、MMP2蛋白在KYSE150細(xì)胞系中表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)與siCtrl組相比，siPGAM5組PGAM5蛋白表達(dá)量顯著降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Bcl-xL、MMP2蛋白表達(dá)水平也顯著降低。提示干擾PGAM5后，可以降低抗凋亡蛋白Bcl-xL的穩(wěn)定性，同時(shí)降低遷移與黏附相關(guān)蛋白相關(guān)MMP2的表達(dá)(圖2)。

①P<0.05。

2.3 siRNA干擾PGAM5后對(duì)食管癌細(xì)胞系增殖和凋亡能力的影響通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)：與siCtrl組相比，siPGAM5組細(xì)胞增殖能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3A)；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與siCtrl組相比，siPGAM5組細(xì)胞凋亡能力顯著增高(圖3B、C)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示干擾PGAM5可以抑制KYSE150細(xì)胞系增殖并促進(jìn)其凋亡。

A：CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖；B、C：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。①P<0.05。

2.4 siRNA干擾PGAM5后對(duì)食管癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移能力的影響通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與siCtrl組相比，siPGAM5組在48 h后的遷移能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4A)，提示干擾PGAM5可以抑制KYSE150細(xì)胞系的遷移能力。同時(shí)通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：siPGAM5組細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯低于siCtrl組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示干擾PGAM5可以抑制KYSE150細(xì)胞系的侵襲能力(圖4B)。

A：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移；B：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲。①P<0.05。

3 討論

PGAM5作為線粒體膜上的蛋白，可通過(guò)多種細(xì)胞壞死性通路參與多種細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)。許多研究表明，細(xì)胞的凋亡和壞死會(huì)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如抗凋亡基因Bcl-xL在肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[10-12]。PGAM5作為一種新發(fā)現(xiàn)的與Bcl-xL相互作用的蛋白在肝損傷、肺纖維化及心臟損傷中發(fā)揮重要作用[13-16]，但在腫瘤中的作用知之甚少。本研究首次發(fā)現(xiàn)了PGAM5在人食管癌細(xì)胞系中的作用。

本研究首先通過(guò)與正常人食管上皮細(xì)胞系比較發(fā)現(xiàn)，人食管癌細(xì)胞系KYSE150的PGAM5蛋白表達(dá)水平異常升高。通過(guò)siRNA技術(shù)干擾人食管癌細(xì)胞系中PGAM5蛋白的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)Bcl-xL蛋白的表達(dá)亦下調(diào)，與之前報(bào)道的肝癌中的結(jié)果相一致[8]，提示干擾PGAM5可以抑制細(xì)胞增殖。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)干擾PGAM5后，MMP2蛋白表達(dá)量隨之降低。作為一種金屬基質(zhì)蛋白酶，MMP2是降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶之一[17]，提示抑制PGAM5蛋白表達(dá)后，可以阻止食管癌細(xì)胞突破基底膜，從而抑制食管癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。為了證實(shí)上述Westren blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)假說(shuō)，進(jìn)一步通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制PGAM5后，KYSE150細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力均顯著降低。

綜上所述，雖然目前對(duì)食管癌的治療仍存在困難，但是隨著對(duì)其發(fā)生發(fā)展機(jī)制了解的更為深入，越來(lái)越多的靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)。本研究提示，PGAM5可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-xL和MMP2的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，但更為詳盡的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。