抗核抗體和抗核抗體譜檢測(cè)結(jié)果分析

夏曉旭 徐思琪*

自身免疫性疾?。ˋID）是指機(jī)體對(duì)自身器官、組織、細(xì)胞的抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致自身機(jī)體損害而引起的疾病。AID患者血液中存在不同針對(duì)自身抗原成分的抗體，即自身抗體，其中最常見的也最重要的自身抗體為抗核抗體（ANA）。ANA是一組將自身真核細(xì)胞的各成分作為靶抗原的抗體，主要存在于血清中。ANA譜和ANA同時(shí)檢測(cè)，或用于ANA陽性標(biāo)本的檢測(cè)，具有重要的補(bǔ)充診斷價(jià)值。本文回顧性分析690例懷疑自身抗體陽性患者，同時(shí)進(jìn)行ANA和ANA譜檢測(cè)，分析兩者的相關(guān)性及其在臨床疾病中的特征。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2018年1月至5月本院檢查ANA和ANA譜的門診及住院標(biāo)本690例，其中男180例，年齡35～92歲，平均年齡65.89歲；女510例，年齡5～88歲，平均年齡57.08歲。臨床診斷為系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）11例，干燥綜合征37例，結(jié)締組織病20例，雷諾綜合癥10例，間質(zhì)性肺病15例，硬皮病7例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎62例，狼瘡性腎炎3例，關(guān)節(jié)病121例，肺部感染155例，痛風(fēng)29例，血小板減少40例，慢性腎炎45例，風(fēng)濕病45例，其他疾?。ㄈ缂⊙?、白細(xì)胞異常等）90例。所有標(biāo)本采用患者空腹靜脈血，離心后分離血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法 （1）抗核抗體檢測(cè)：①操作流程：試劑來源于德國(guó)歐蒙（EUROIMMUN）公司抗核抗體IgG檢測(cè)試劑盒（間接免疫熒光法），貨號(hào)FC 1510-1010-1，采用間接免疫熒光法檢測(cè)。每個(gè)反應(yīng)區(qū)含有兩種抗原基質(zhì)片：猴肝組織和Hep-2細(xì)胞。用PBS緩沖液以1∶100稀釋血清，取25μl稀釋好的樣本加入生物載片，溫育30min，PBS緩沖液沖洗、浸泡5min，取20μl FITC標(biāo)記二抗加入生物載片，溫育30min，PBS緩沖液沖洗、浸泡5min，最后用封片介質(zhì)封片。采用Olympus顯微鏡觀察熒光結(jié)果。對(duì)1∶100稀釋標(biāo)本熒光強(qiáng)度顯示為中等或強(qiáng)陽性的標(biāo)本進(jìn)一步行1∶1000稀釋，重復(fù)上述操作步驟后觀察熒光結(jié)果。②抗體滴度判斷：由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的檢驗(yàn)技師觀察基質(zhì)片熒光強(qiáng)度，依照試劑說明書對(duì)抗體滴度進(jìn)行判斷，所有熒光基質(zhì)片結(jié)果得到另一位經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的主管技師復(fù)核。根據(jù)歐蒙公司抗核抗體IgG檢測(cè)試劑盒（間接免疫熒光法）產(chǎn)品說明書有關(guān)抗體滴度的判斷，可根據(jù)不同稀釋度血清所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度進(jìn)行判斷，具體如下：若1∶100稀釋后熒光陰性，報(bào)告ANA“陰性”；1∶100稀釋后熒光強(qiáng)度弱陽性，1∶1000稀釋后熒光陰性，報(bào)告ANA“1∶100陽性”；1∶100稀釋后熒光中等，1∶1000稀釋后熒光陰性，可推斷報(bào)告為ANA“1∶320陽性”；1∶100稀釋后熒光強(qiáng)，1∶1000稀釋后熒光弱陽性，報(bào)告ANA“1∶1000陽性”。（2）抗核抗體譜檢測(cè)：①操作流程：試劑來源于深圳亞輝龍生物科技股份有限公司的抗核抗體譜檢測(cè)試劑盒，采用免疫印跡法檢測(cè)。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，孵育液封閉5min，加入稀釋的血清，孵育30min，血清中若含有特異性抗體則會(huì)與膜上的抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌，加入HRP-IgG孵育30min，洗滌后加入底物液孵育10min，顯色后加入終止液。②結(jié)果判斷：根據(jù)條帶顯色位置判斷血清中存在的相應(yīng)抗體。

1.3 觀察指標(biāo) 根據(jù)ANA和ANA譜檢測(cè)結(jié)果，分析ANA滴度在不同疾病中的分布特征、ANA譜檢測(cè)的特異性抗體與疾病的相關(guān)性、不同特異性抗體與ANA滴度是否存在一定的關(guān)聯(lián)及不同疾病ANA陽性率和特異性抗體的檢出情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 正態(tài)性檢驗(yàn)采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANA滴度在不同疾病中的分布 690例懷疑自身抗體陽性的臨床標(biāo)本中，ANA陽性標(biāo)本為494例，陽性率71.6%。其中ANA滴度為1∶100陽性標(biāo)本186例，陽性率27.0%；ANA滴度為1∶320陽性標(biāo)本90例，陽性率13%；ANA滴度為1∶1000陽性標(biāo)本218例，陽性率31.6%。見表1。

表1 ANA滴度在部分疾病中的分布［n（%）］

2.2 ANA譜檢測(cè)特異性自身抗體情況 ANA譜檢測(cè)特異性自身抗體陽性標(biāo)本共245例，占總標(biāo)本數(shù)35.5%，其中ANA陽性且ANA譜陽性的標(biāo)本為235例，占ANA陽性標(biāo)本數(shù)的47.6%；ANA陽性而ANA譜陰性的標(biāo)本259例，占ANA陽性標(biāo)本數(shù)的52.4%；ANA陰性而ANA譜陽性的標(biāo)本10例，占總標(biāo)本數(shù)1.4%，主要為抗Ro-52抗體；在ANA譜陽性的標(biāo)本中多數(shù)能檢測(cè)到抗SSA、Ro-52抗體，其存在無疾病特異性；抗SSB抗體的出現(xiàn)常伴隨抗SSA抗體；抗Nucleosome、抗dsDNA抗體僅存在于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中；硬皮病、雷諾綜合癥患者血清中僅檢測(cè)到抗Cenp B抗體；未能檢測(cè)到抗PCNA、抗PM-Scl抗體。見表2。

表2 ANA譜檢測(cè)特異性自身抗體情況及其主要存在的疾病

2.3 ANA滴度與ANA譜的相關(guān)性 690例懷疑自身抗體陽性的臨床標(biāo)本中，ANA陰性標(biāo)本196例，其中10例標(biāo)本ANA譜陽性，主要抗體為抗Ro-52；ANA陽性標(biāo)本為494例，其中ANA譜陽性標(biāo)本235例，主要抗體為抗SSA、抗Ro-52?？购诵◇w、抗dsDNA、抗組蛋白、抗Sm、抗U1-nRNP抗體陽性標(biāo)本ANA滴度均較高，多為1∶320或1∶1000；抗Cenp B、抗SSB、抗AMA-M2抗體陽性標(biāo)本ANA滴度主要也集中在較高水平；抗SSA、抗Ro-52、抗Scl-70、抗Jo-1抗體陽性標(biāo)本可存在于各種滴度的ANA陽性標(biāo)本中，無明顯ANA滴度分布特征。見表3。

表3 ANA滴度與特異性自身抗體的相關(guān)性［n（%）］

2.4 不同疾病中ANA和ANA譜檢測(cè)分析 系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、結(jié)締組織病、硬皮病等自身免疫性疾病ANA陽性率高；抗核小體抗體、抗dsDNA抗體、抗Sm抗體具有較強(qiáng)的疾病特異性；抗SSA抗體、抗Ro-52抗體可存在于多種疾病，無特異性。見表4。

表4 不同疾病中ANA陽性率和特異性抗體分布特征（%）

3 討論

當(dāng)機(jī)體免疫自穩(wěn)功能發(fā)生紊亂或外來抗原與自身成分間存在交叉反應(yīng)等原因時(shí)，易刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)自身抗原的抗體（即自身抗體），這些自身抗體會(huì)攻擊機(jī)體自身的器官、組織、細(xì)胞而導(dǎo)致機(jī)體損害甚至疾病發(fā)生。自身抗體可存在于自身免疫性疾病患者體內(nèi)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡；亦可存在于其他繼發(fā)性免疫反應(yīng)患者體內(nèi)，如肺部感染；同時(shí)，微量自身抗體也能存在于一些正常人血液中，如抗甲狀腺球蛋白抗體。

自身抗體尤其是抗核抗體的檢測(cè)對(duì)自身免疫性疾病的診斷、預(yù)后評(píng)估有重要作用［1］，對(duì)某些繼發(fā)性免疫反應(yīng)的病情判斷亦有著不可忽視的作用。血清學(xué)檢測(cè)ANA已成為臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。間接免疫熒光法檢測(cè)ANA是較公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”［2-3］，但由于其針對(duì)細(xì)胞內(nèi)總抗體進(jìn)行檢測(cè)，具有敏感性高而疾病特異性相對(duì)較差的特點(diǎn)，間接免疫熒光法檢測(cè)ANA陽性患者還需進(jìn)行免疫印跡法檢測(cè)ANA譜特異性抗體，以協(xié)助臨床診斷。

本資料顯示，690例懷疑自身抗體陽性的標(biāo)本中，ANA陽性標(biāo)本494例，SLE、結(jié)締組織病、干燥綜合征等自身免疫性疾病ANA滴度多＞1∶100，這與試劑說明書中提及的“ANA滴度1∶320提示患有某種風(fēng)濕病”相符；肺部感染、慢性腎炎、關(guān)節(jié)病、痛風(fēng)等疾病ANA陽性率在45%～60%左右，滴度分布無明顯規(guī)律；其他如白細(xì)胞異常、糖尿病、橋本甲狀腺炎等疾病ANA陽性率較低。本資料中ANA陽性率總體較高，可能原因是該陽性率指在ANA陽性疑似患者中的概率，而非在普通人群中的概率。

ANA譜特異性抗體陽性標(biāo)本為245例，其中ANA陰性而ANA譜陽性標(biāo)本10例，ANA陽性且ANA譜陽性標(biāo)本235例，兩種方法并不完全一致，不可代替，這與多位學(xué)者的報(bào)道一致［4-5］。由于間接免疫熒光法檢測(cè)ANA存在基質(zhì)片部分抗原分布不均、含量較低的情況，可能導(dǎo)致ANA陰性而ANA譜特異性抗體檢測(cè)陽性情況出現(xiàn)。因此，中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)風(fēng)濕免疫科醫(yī)師分會(huì)自身抗體檢測(cè)專業(yè)委員會(huì)于2018年出臺(tái)《抗核抗體檢測(cè)的臨床應(yīng)用專家共識(shí)》［6］，指出“臨床檢測(cè)中存在IIF-ANA陽性而針對(duì)靶抗原的特異性自身抗體檢測(cè)結(jié)果陰性，甚至IIF-ANA陰性而針對(duì)靶抗原的特異性自身抗體檢測(cè)結(jié)果陽性的情況。因此，當(dāng)臨床高度疑診AID時(shí)，不論ANA總抗體檢測(cè)結(jié)果如何，均需對(duì)靶抗原的特異性自身抗體進(jìn)行檢測(cè)?！?/p>

抗核小體、抗dsDNA、抗Sm、抗U1-nRNP抗體陽性多見于SLE，且標(biāo)本ANA滴度均較高；雷諾綜合癥和硬皮病患者抗Cenp B抗體陽性，干燥綜合征患者可見抗SSA和抗SSB抗體同時(shí)陽性，ANA滴度也多偏高，這與作者對(duì)特異性自身抗體的認(rèn)識(shí)相符［7］。有些疾病如結(jié)腸炎、胰腺炎、糖尿病、肝功能異常等ANA陽性，但ANA譜陰性，可能原因在其會(huì)產(chǎn)生除ANA外的其他自身抗體，但由于目前診斷試劑的特異性不夠強(qiáng)，可能會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，而導(dǎo)致ANA陽性，另一個(gè)原因在于，患者本身即ANA陽性，需要進(jìn)一步檢查明確病因。

ANA和ANA譜陽性可出現(xiàn)在各種的疾病中，兩種方法不能替代，ANA譜特異性抗體檢測(cè)對(duì)ANA檢測(cè)陽性的標(biāo)本具有補(bǔ)充診斷作用，同時(shí)檢測(cè)ANA和ANA譜能更好的為臨床診斷和評(píng)估預(yù)后提供幫助。一種疾病可出現(xiàn)多種特異性自身抗體陽性，一種抗體也能出現(xiàn)在多種疾病中，因此當(dāng)ANA或ANA譜報(bào)告陽性時(shí)，臨床醫(yī)師還需結(jié)合患者其他檢查和臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合評(píng)估。