植物乳桿菌凍干保護劑的篩選及凍干工藝的研究

張 菊， 蘇成文， 亓 鵬， 陳 焱， 孫得發(fā)

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，山東濰坊 261061）

真空冷凍干燥（簡稱為凍干）是目前制備和保藏微生物的有效方法，凍干是將冷凍技術和干燥技術進行有機結合。微生物在真空冷凍干燥過程中要經(jīng)受冷凍和干燥兩種激烈因素的影響，損傷是難以避免的。乳酸菌在真空冷凍干燥過程中，通常會造成細胞膜通透性發(fā)生改變、蛋白質變性失活、pH的動態(tài)平衡被打破、DNA發(fā)生損傷以及膜脂肪酸組成發(fā)生改變等（張英華等，2006）。影響乳酸菌在凍干后效果的因素有很多，如菌株、菌體的大小及其形狀、菌種的菌齡、初始菌種的濃度、pH、相應的保護劑系統(tǒng)、預凍的溫度、降溫的速率、冷凍干燥的條件、細胞的含水量、細胞膜的成分和復水的條件等（李華等，2002），若在凍干的過程中采取一定的保護措施，加入適宜的有效保護劑系統(tǒng)，同時采用適合特定菌株的預凍溫度和預凍時間，可以在最大程度上減輕或有效避免真空冷凍干燥對細胞帶來的損傷。

低聚糖又稱為寡糖，由2～10個單糖分子通過糖苷鍵聚合而成的直鏈或支鏈化合物，其包括功能性低聚糖和普通低聚糖。功能性低聚糖一般很難被消化吸收，但是可以被腸道中的微生物發(fā)酵利用。其具有增加胃腸道蠕動、提高機體免疫力、抗病毒、抑制腐敗菌生長、促進有益菌增殖等一系列特殊的生理保健作用。功能性低聚糖作為凍干保護劑，具有保健和凍干保護的雙重作用，可以使益生菌維持較高的成活率；當機體食入功能性低聚糖作為益生菌凍干保護劑的產(chǎn)品后，功能性低聚糖將繼續(xù)發(fā)揮益菌保健、促生長的作用（王瑩等，2010），功能性低聚糖可以將益菌作用和凍干保護作用結合起來，將在醫(yī)藥、食品和飼料生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用。

本試驗選擇目前益菌和促菌生長效果比較好的功能性低聚糖：低聚木糖、低聚果糖、水蘇糖、低聚異麥芽糖，分別研究其對植物乳桿菌凍干后的保護效果，選擇其中一種功能性低聚糖作為凍干保護劑。再與目前乳酸菌凍干效果比較好的脫脂奶粉、海藻糖和甘油復配，通過正交試驗對其濃度進行優(yōu)化。同時對凍干工藝進行初步探索，旨在為植物乳桿菌的凍干保護研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基 植物乳桿菌：本實驗室保存的菌種。

培養(yǎng)基：MRS固體和液體培養(yǎng)基。

1.2 原料 低聚木糖、低聚果糖、水蘇糖、低聚異麥芽糖、海藻糖（純度＞99%）和脫脂奶粉為食品級，甘油為化學純。以上保護劑分別用蒸餾水配制成高濃度的貯備液，單獨滅菌后，按試驗設計配制成各種復合保護劑。

1.3 儀器與設備 微生物實驗室常用的儀器設備為：FDU-1100真空冷凍干燥機（日本，東京理化），SW-CJ-2F垂直流雙人雙面凈化工作臺 （江蘇，蘇州凈化），DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱（西安禾普）和DHP-360數(shù)顯電熱恒溫培養(yǎng)箱（江蘇，金壇市天竟實驗儀器廠），TCYQ DHZ-CA大容量振蕩器（江蘇，太倉市實驗設備廠），DW-86L578J超低溫冰箱（青島海爾），高速冷凍離心機（德國 sigma，3-18K）等。

1.4 菌株的培養(yǎng)和懸浮液的制備 植物乳桿菌經(jīng)MRS固體斜面培養(yǎng)基傳代活化恢復活力后，接入滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h左右，以此作為植物乳桿菌的種子液。以1%的量再次接種入滅菌后MRS液體培養(yǎng)基中，使植物乳桿菌處于對數(shù)生長期后期，然后分裝于50 mL無菌離心管中，置于高速冷凍離心機（10000 r/min），4 ℃離心 10 min，棄去上清液，將菌泥稱重后按照1：1的比例加入滅菌生理鹽水（0.9%的濃度），用小型快速振蕩器快速混合均勻后，制成植物乳桿菌的菌懸液，取2 mL菌懸液進行計數(shù)（作為凍干前的活菌總數(shù)），再將剩余的菌懸液分裝于無菌的10 mL凍干管中，每管2 mL菌懸液，按照試驗的具體要求加入相應的凍干保護劑。

1.5 冷凍干燥 將上述制備好的菌懸液置于-20℃（或-70℃）的溫度下預凍，等其完全凍結后，迅速將凍結樣品移入真空冷凍干燥機中冷凍干燥24～48 h，使凍干后菌粉的含水量達3%左右，然后測定凍干后植物乳桿菌的活菌數(shù)。

1.6 菌落總數(shù)測定 參考國家標準GB 4789.35-2016乳酸菌檢驗方法，測定植物乳桿菌的菌落總數(shù)。存活率計算公式為：

1.7 凍干保護劑配方的選擇 首先進行功能性低聚糖的單因子試驗，挑選對植物乳桿菌凍干后保護效果最佳的功能性低聚糖，再選擇脫脂奶粉、海藻糖和甘油，進行最優(yōu)復合保護劑配方的篩選。通過設計4因素3水平的正交試驗L9（34）確定最優(yōu)植物乳桿菌復合保護劑配方組合。

1.8 預凍溫度和預凍時間 將上述制備好的菌懸液統(tǒng)一加入上述篩選的最優(yōu)復合保護劑后，分別置于-20℃和-70℃的低溫條件下預凍2、4、6 h，將樣品完全凍結后取出，然后對其進行真空冷凍干燥，最后進行活菌計數(shù)，計算出冷凍干燥后植物乳桿菌的存活率。

1.9 菌泥與水混合比例的選擇 植物乳桿菌的菌泥與水的比例分別按 0.25：1、0.50：1、0.75：1、1.00：1、1.25：1進行混合，統(tǒng)一加入上述篩選的最優(yōu)復合保護劑后轉入凍干管中，然后將其進行真空冷凍干燥后進行活菌計數(shù)，計算出冷凍干燥后植物乳桿菌的存活率。

2 結果與分析

2.1 功能性低聚糖單因子的試驗結果 由表1可知，所選的四種功能性低聚糖均對乳酸菌凍干有較好的保護效果，起保護效果的順序依次為：低聚木糖＞低聚果糖＞水蘇糖＞低聚異麥芽糖。為達到較好的試驗效果，本試驗以低聚木糖作為研究對象，對乳酸菌凍干保護劑最佳配方的選擇。

表1 功能性低聚糖單因子的試驗結果

2.2 正交試驗設計優(yōu)化復合保護劑 脫脂奶粉是一種凍干效果較好的大分子物質，在冷凍干燥時，奶粉中的乳清蛋白能在菌體外形成蛋白膜保護層，對細胞加以保護，同時可固定凍干酶類；奶粉中其他成分也有助于提高菌體的凍干存活率（徐致遠等，2006）。海藻糖是一種二糖，由兩個葡萄糖構成，具有大量的自由羥基，是具有極強穩(wěn)定性的非還原性雙糖，玻璃化溫度更高，吸濕性更低，在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等條件下在細胞表面能形成獨特的保護膜，保護蛋白質分子不變性失活（張敬如等，2006）。甘油（又稱丙三醇）是一種多羥基化合物，能滲透到細胞內部。在凍干過程中可部分取代水分子與菌體細胞膜磷脂中的磷酸基團 （或者與菌體蛋白質極性基團）形成氫鍵，使菌體中的大分子物質在缺水狀態(tài)下仍能保持原有的功能結構，維持菌體活力（朱敖蘭等，2007）。

根據(jù)文獻報道和試驗結果（索江華等，2015；張炎等，2015；熊濤等，2011；張英華等，2006）選擇脫脂奶粉、海藻糖、甘油和低聚木糖進行正交試驗優(yōu)化植物乳桿菌的最佳配方組合，不同比例保護劑在凍干后對植物乳桿菌存活率的影響如表2所示。

表2 植物乳桿菌凍干保護劑篩選

通過直觀極差分析法可以看出（表2），影響因素依次為 D（低聚木糖）＞A（脫脂奶粉）＞B（海藻糖）＞C（甘油），得出最佳配方組合為：A3B2C2D3，即奶粉20%，海藻糖10%，甘油2%，低聚木糖5%。2.3 最佳配方的試驗驗證 由于最佳的配方組合未包含在正交試驗的9個試驗中，為了進一步確定凍干保護及配方的試驗效果，按照最佳組合A3B2C2D3，再次做了三次驗證試驗，每次試驗兩個重復，其存活率均為80%左右（表3）。

表3 最佳組合的試驗驗證

2.4 預凍溫度和預凍時間的確定 試驗選擇-20、-70℃，時間為2、4 h和6 h。預凍溫度及凍結時間對植物乳桿菌存活率的影響見表4。由表4的結果可以看出，預凍溫度對所研究的植物乳桿菌的影響不大。隨預凍時間延長，植物乳桿菌存活率緩慢上升。根據(jù)試驗結果得出，預凍的最適宜條件：預凍時間6 h，預凍溫度-70℃。

表4 預凍溫度和預凍時間對植物乳桿菌存活率的影響

2.5 菌泥與水混合比例的確定 由表5可知，菌泥與水的混合比例對植物乳桿菌的凍干存活率也有一定影響作用。菌泥太多，水的量太少，加入保護劑后容易攪拌不均勻，影響真空冷凍干燥后產(chǎn)品的性狀。本試驗結果表明，水的含量越少，凍干后菌體的存活率最高，而且凍干時間縮短，節(jié)約能耗。但是水的量也不能加入太少，要保證凍干保護劑、菌泥和水混合均勻，建議水與菌泥最佳比例為0.5：1。

表5 水與菌泥混合比例對植物乳桿菌存活率的影響

3 討論

功能性低聚糖（或稱寡糖）因其獨特的生理功能，在營養(yǎng)保健、疾病預防、畜牧生產(chǎn)養(yǎng)殖等方面得到廣泛的應用。目前已成功開發(fā)的功能性寡糖有低聚果糖（FOS）、低聚木糖（XOS）、低聚異麥芽糖（IMO）、大豆低聚糖（SBOS）、甘露寡糖（MOS）、低聚半乳糖（GOS）、低聚異麥芽酮糖、低聚龍膽糖、低聚殼聚糖和水蘇糖等（閔力等，2012）。功能性低聚糖一般不被人和動物腸道所分泌的消化酶消化，但其可以明顯促進腸道有益菌的增殖，抑制腸道病原菌的繁殖，從而調節(jié)腸道微生物菌群的平衡，有益于人和動物腸道菌群的健康，最終提高機體的免疫能力。目前研究發(fā)現(xiàn)功能性低聚糖也會調節(jié)動物體內的脂類代謝和蛋白質代謝，同時增強動物對礦物質（如鈣元素）的吸收等多種生理作用（劉紅梅等，2012；朱俊玲等，2003）。功能性低聚糖具有無毒副作用、無殘留、無耐藥性、綠色、安全、環(huán)保和穩(wěn)定性強等特點，對功能性低聚糖的深入研究和開發(fā)應用具有廣闊的發(fā)展前景。

目前，關于功能性低聚糖的益菌作用研究比較廣泛，但是作為益生菌凍干保護劑的研究還不是很深入，功能性低聚糖含有2～10個相同或不同的單糖，每個單糖均含有自由羥基，在凍干過程中的作用機理與甘油類似，其羥基可部分取代水分子與菌體細胞膜磷脂中的磷酸基團 （或者與菌體蛋白質極性基團）形成氫鍵，使菌體中的大分子物質在缺水狀態(tài)下仍能保持原有的功能結構。Schwab等（2007）發(fā)現(xiàn)，低聚果糖能明顯提高乳酸桿菌TMW1.106在干燥以及存儲過程中的存活率，推測低聚果糖可以提高乳酸桿菌細胞膜的完整性，增加細胞膜的側壓力，最終細胞膜的流動性得到提高，導致存活率提高。功能性低聚糖通過覆蓋在生物分子表面，保持了細胞表面的溶劑化和天然性質，維持在冷凍干燥狀態(tài)下乳酸菌細胞中水的含量，從而適度保存和避免其不受傷害（Noori等，2017）。

微生物制劑在真空冷凍干燥之前，首先要進行預凍處理。預凍是將溶液中的自由水進行固化，使真空干燥后產(chǎn)品的形態(tài)不發(fā)生變化，防止在真空干燥時發(fā)生起泡、濃縮、收縮和溶質移動等不可逆的變化，減少由于溫度下降引起的物質可溶性降低以及生命特性發(fā)生變化（王娜等，2011）。純水可以在0℃固化結晶，但不同物料中的液體是含有不同溶質的水溶液，所以導致其凍結溫度各不相同，將物料中水溶液完全凍結時的溫度稱為其共晶溫度。不同物質、同一物質含水量不同，其共晶溫度也隨之變化。預凍溫度和預凍時間也是影響整個凍干周期的重要因素，許多觀點認為生物體在快速降溫的過程中，細胞內冰晶的產(chǎn)生是細胞損傷的主要原因（Shao等，2014）。

本試驗結果表明，四種低聚糖對植物乳桿菌的保護率效果依次為：低聚木糖＞低聚果糖＞水蘇糖＞低聚異麥芽糖，選擇低聚木糖與目前乳酸菌凍干效果比較好的脫脂奶粉、海藻糖和甘油復配，通過正交試驗對其濃度進行優(yōu)化，得出最佳配方組合為：奶粉20%，海藻糖10%，甘油2%，低聚木糖5%。進一步驗證試驗結果表明，其存活率為80%左右。對植物乳桿菌凍干工藝的研究發(fā)現(xiàn)，最佳的預凍溫度和時間分別是-70℃，6 h；菌泥與水不同比例混合凍干后，隨著水分的增加，植物乳桿菌菌的存活率緩慢下降，建議水與菌泥最佳比列為0.5：1。經(jīng)過凍干保護劑和凍干條件的優(yōu)化，植物乳桿菌的存活率達到80%以上。通過對植物乳桿菌的凍干保護劑和凍干工藝的優(yōu)化，可以為以后植物乳桿菌的凍干研究提供理論參考。