基于油水分配系數(shù)與指標(biāo)成分含量的甘草增溶作用研究

王舒琪，忻曉東，頓佳穎，李春花，3*

(1.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，河北 石家莊 050090； 2.涿州市醫(yī)院，河北 保定 072750;3.河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050090)

溶解度是影響藥物有效成分溶出的關(guān)鍵因素，中藥材中存在很多藥理活性強(qiáng)但因溶解度小而限制了其臨床應(yīng)用，影響臨床效果的成分[1]。有研究表明中藥復(fù)方配伍以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，可利用特定藥材如甘草自身成分具有增溶的性質(zhì)增加難溶性成分溶解度。李鳴[2]曾以四君子湯為例，比較藥材單煎液、藥材與甘草合煎液中水溶出物的量，表明甘草具有增溶作用。甘草作為中醫(yī)常用藥物之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)脾益氣、緩急止痛、清熱解毒、祛痰止咳、調(diào)和諸藥等功效，主要有效成分為甘草酸，屬于三萜皂苷，具有表面活性劑的性質(zhì)[3]能夠增強(qiáng)合煎液中其它藥材難容性成分的溶解度。研究表明，甘草的增溶原理基于甘草酸可形成膠束[4]。

桃核承氣湯原方出自《傷寒論》，作為活血祛瘀的代表方及經(jīng)典名方之一，主治下焦蓄血癥，可逐瘀瀉熱，其臨床應(yīng)用廣泛，具有確實(shí)的療效，可用于治療急性腦卒中、多發(fā)性腦梗塞、腦出血術(shù)后并發(fā)癥、糖尿病并發(fā)腦梗死、肝性腦病等由瘀熱互結(jié)所致疾病[5]。該方組方精簡，由桃仁、大黃、桂枝、甘草、芒硝組成?，F(xiàn)代研究及臨床應(yīng)用研究表明[6-9]，桃核承氣湯中發(fā)揮其藥理作用的成分主要為苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黃酸、大黃素及大黃酚等蒽醌類成分。本實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證甘草增溶原理，以桃核承氣湯為例，分別計(jì)算桃仁(S1)、大黃(S2)、桂枝(S3)、甘草(S4)單煎液；桃仁+甘草(S5)、大黃+甘草(S6)、桂枝+甘草(S7)合煎液；桃仁+大黃+桂枝(S8)合煎液；桃仁+大黃+桂枝+甘草(S9)合煎液的油水分配系數(shù)，并采用高效液相色譜法對(duì)藥材的單煎液與合煎液進(jìn)行有效成分含量測定。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；TG328B型電子分析天平(上海精科儀器廠)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；FD-1-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

苦杏仁苷(批號(hào)：Z1709131，成都草源康生物科技有限公司，純度：98.00%)；大黃酸(批號(hào)：MUST-11032801，成都曼斯特生物科技有限公司，純度：98.00%)；大黃素(批號(hào)：MUST-12022715，成都曼斯特生物科技有限公司，純度：98.00%)；大黃酚(批號(hào)：20120320，上海源葉生物科技有限公司，純度：98.00%)；蘆薈大黃素(批號(hào)：20120412，上海源葉生物科技有限公司，純度：98.00%)；大黃素甲醚(批號(hào)：PF0223SA13，上海源葉生物科技有限公司，純度：98.00%)；桂皮醛(批號(hào)：H02M6Q1，上海源葉生物科技有限公司，純度≧98.00%)；甘草酸(批號(hào)：MUST-17032205，成都曼斯特生物科技有限公司，純度：99.55%)； SAS 67120型超純水系統(tǒng)(法國Millipore公司)；正辛醇(分析純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠)；乙腈(色譜純，天津市康科德科技有限公司)；甲醇(色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；磷酸(分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司)。

藥材均購于河北省石家莊市樂仁堂藥店，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院侯芳潔老師鑒定桃仁為薔薇科植物桃Prunuspersica(L.) Batsch 的干燥成熟種子，大黃為廖科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根及根莖，桂枝為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝，甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 油水分配系數(shù)的測定

2.1.1 單味藥材的提取與浸出物的測定

按處方比例分別稱取桃仁1.5 g(S1)、大黃6 g(S2)、桂枝3 g(S3)、甘草3 g(S4)，置于250 mL圓底燒瓶中，加10倍量的水，回流提取3次，時(shí)間為65 min、32.5 min、32.5 min，過濾[10]，收集濾液。合并3次收集的濾液，將濾液濃縮至30 mL。取濃縮液10 mL，置于80 ℃水浴鍋蒸發(fā)至稠浸膏狀態(tài)，放入冰箱中，于-25 ℃預(yù)凍10 h，冷凍干燥成干浸膏，稱重。另取10 mL濃縮液，加10 mL正辛醇萃取，分離油相與水相，同法制成干浸膏，稱重。

2.1.2 單味藥材加甘草提取與浸出物的測定

按處方比例分別稱取桃仁1.5 g+甘草3 g(S5)、大黃6 g+甘草3 g(S6)、桂枝3 g+甘草3 g(S7)進(jìn)行提取與浸出物的測定，提取與測定方法同上述“2.1.1”項(xiàng)單味藥材的提取與測定。

2.1.3 復(fù)方提取與浸出物的測定

按處方比例稱取全方藥材一付(不含芒硝與甘草)即：桃仁1.5 g,大黃6 g,桂枝3 g(S8) ，另取一付藥材(不含甘草)即：桃仁1.5 g,大黃6 g,桂枝3 g,甘草3 g(S9)，分別對(duì)以上兩個(gè)復(fù)方進(jìn)行提取與浸出物的測定，提取與測定方法同上述“2.1.1”項(xiàng)單味藥材的提取與測定。

2.1.4 油水分配系數(shù)的計(jì)算

依據(jù)油水分配系數(shù)的公式即logP=log(W油/W水)，其中W油為油相浸膏質(zhì)量，W水為水相浸膏質(zhì)量，對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表1。結(jié)果表明不含甘草藥材的油水分配系數(shù)均大于含甘草藥材的油水分配系數(shù)，說明了桃核承氣湯中甘草能夠增加其它藥物成分在水中溶解度。

表1 油水分配系數(shù)結(jié)果

2.2 指標(biāo)成分含量測定

2.2.1 液相條件

色譜柱為 Diamonsil C18(5 μm,250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相為乙腈和0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，15%乙腈；5～10 min，15%～20%乙腈；10～30 min，20%乙腈；30～55 min，20%～50%乙腈；55～70 min，50%乙腈；70～85 min，50%～80%乙腈；85～90 min，80%～100%乙腈；90～95 min，100%乙腈；體積流量1.0 mL/min ；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；苦杏仁苷檢測波長為210 nm，大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、甘草酸檢測波長為250 nm，桂皮醛檢測波長為290 nm。

2.2.2 供試品溶液制備

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下剩余濃縮液1 mL置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻靜置，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得單味藥材供試品溶液。同理，取“2.2.2”項(xiàng)和“2.2.3”項(xiàng)的濃縮液，按上述操作，即得單味藥材加甘草、復(fù)方的供試品溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液制備

分別稱取苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素適量，各置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.278、0.554、1.234、0.236、0.264、0.258、0.244、0.242 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。依次取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液2、1、2、1、1、1、1、1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.4 專屬性試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液及“2.2.3”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液各 10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果顯示，各成分分離度良好，理論塔板數(shù)以苦杏仁苷峰計(jì)不低于3 000，說明該方法專屬性強(qiáng)。色譜圖見圖1。

注：A.桃仁;B.桃仁+甘草;C.大黃;D.大黃+甘草;E.桂枝;F.桂枝+甘草;G.甘草;H.混標(biāo);1.苦杏仁苷;2.蘆薈大黃素;3.大黃酸;4.大黃素;5.大黃酚;6.大黃素甲醚;7.甘草酸;8.桂皮醛

2.2.5 線性關(guān)系的考察

精密量取混合對(duì)照品溶液1、5、10、15、20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量(x，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍(n=5)

2.2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液，分別在確定的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積?？嘈尤受铡⒐鹌と?、甘草酸、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素峰面積的RSD分別為0.390 9%、0.258 5%、0.119 2%、0.416 2%、0.307 2%、0.337 0%、0.455 0%、0.236 9%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12 h，按所確定的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素峰面積的RSD分別為0.276 6%、0.246 0%、0.225 0%、0.203 0%、0.858 4%、0.262 4%、0.857 3%、0.591 2%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按所確定的方法平行制備6份，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素含量的RSD分別為0.326 7%、0.562 1%、0.232 8%、0.323 8%、0.471 8%、0.172 3%、0.399 3%、0.271 3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量供試品溶液6份，每份0.1 mL，按照100%分別加入 8 種化合物對(duì)照品，制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，并計(jì)算各成分的加樣回收率，結(jié)果苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的平均加樣回收率范圍在99.21%～100.60%，RSD均小于3%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.2.10 樣品含量測定

按上述“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行提取，“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見表3。由表3可知，單味藥材加甘草后的和煎液中除甘草酸外指標(biāo)成分含量均高于單味藥材煎液中指標(biāo)成分的含量，甘草酸的含量降低，進(jìn)而說明甘草酸可以通過形成膠束來增大其他成分在水中的溶解度[4]。

表3 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 甘草增溶原理

查閱參考文獻(xiàn)可知[11-13]，甘草中的甘草酸可通過形成膠束來發(fā)揮增溶作用，甘草酸具有表面活性劑的性質(zhì)，存在親水親油兩親性結(jié)構(gòu)，當(dāng)其濃度達(dá)到臨界膠束濃度時(shí)，親水基團(tuán)向外與水相相連，疏水基團(tuán)則相互吸引、締合在一起，向內(nèi)形成球狀體即為膠束，能顯著提高其他成分在水中的溶解度。

3.2 油水分配系數(shù)測定

油水分配系數(shù)(logP)是指物質(zhì)在正辛醇和水中分配系數(shù)比值的對(duì)數(shù)值，反映了物質(zhì)在油水兩相中的分配情況，logP值越小，說明該物質(zhì)越親水，水溶性越好，反之logP值越大越親油。本實(shí)驗(yàn)以桃核承氣湯為例，測定了除芒硝外單味藥材、單味藥材加甘草、桃仁+大黃+桂枝及桃仁+大黃+桂枝+甘草的油水分配系數(shù)，結(jié)果顯示，無論是單味藥材還是除甘草外的藥材合煎液加甘草后油水分配系數(shù)均降低，說明加甘草后的藥液水溶性成分增多，進(jìn)而驗(yàn)證了甘草可以增加其他成分在水中的溶解度。

3.3 指標(biāo)成分的確定及其溶解度

基于桃核承氣湯方中組成藥物的藥理作用與此方的主要臨床應(yīng)用，可得出本方中主要指標(biāo)成分有苦杏仁苷、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、桂皮醛及甘草酸。其中大黃的指標(biāo)成分為游離蒽醌，桂枝的指標(biāo)成分為揮發(fā)油，此類成分極性較小，幾乎不溶于水，故為驗(yàn)證甘草增溶的原理，本實(shí)驗(yàn)選取以上成分為指標(biāo)成分，采用HPLC測定藥材單煎液、藥材與甘草合煎液、桃仁+大黃+桂枝及桃仁+大黃+桂枝+甘草中成分含量，并進(jìn)行方法學(xué)研究，結(jié)果顯示，加甘草后的合煎液中指標(biāo)成分含量除甘草酸外均增加，從而驗(yàn)證了甘草酸能夠增大其他成分在水中的溶解度。

4 結(jié)論

在臨床應(yīng)用的常用經(jīng)方中，大部分方劑組成中含有甘草這味藥。甘草在方劑的組成中多起著調(diào)和諸藥、增強(qiáng)療效的作用，其功兼佐使之用。而本文通過對(duì)桃核承氣湯中基于油水分配系數(shù)與指標(biāo)成分含量的甘草增溶作用研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出甘草具有增溶的作用，且主要通過甘草酸形成膠束來實(shí)現(xiàn)[14]。從而在理論上對(duì)甘草調(diào)和諸藥、增強(qiáng)療效的作用做出了相對(duì)科學(xué)的解釋。因此，對(duì)于甘草增溶作用的研究對(duì)以桃核承氣湯為代表的經(jīng)典名方的臨床應(yīng)用更具現(xiàn)實(shí)與理論意義，可助其充分發(fā)揮其作為經(jīng)典名方的臨床治療優(yōu)勢。為完善甘草增溶作用相關(guān)研究，后期研究將進(jìn)一步探索甘草酸膠束的具體參數(shù)。