陽和化巖湯對(duì)乳腺癌癌前病變細(xì)胞P53、Ki67表達(dá)的影響研究

王曉娜,劉曉菲,2*,孫穎,李斐斐,史文嫻

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355； 2.山東省中醫(yī)經(jīng)典名方協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250014; 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

乳腺癌的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，是最常見的女性惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，乳腺癌現(xiàn)居全球女性惡性腫瘤首位[1]。近年來，其發(fā)病率不斷升高且趨于年輕化[2]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的結(jié)合，中藥在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中有一定的預(yù)防和治療作用[3]。其中，Ki67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，能夠確切反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性,與乳腺癌的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[4]。P53是目前所知的一種重要的抑癌基因，但其突變會(huì)成為癌基因。本研究主要通過免疫細(xì)胞化學(xué)法和半定量RT-PCR法檢測(cè)陽和化巖湯及拆方對(duì)Ki67、P53表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

乳腺癌癌前病變MCF-10AT細(xì)胞由上海龍華醫(yī)院陳紅風(fēng)主任惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)，Gibco公司產(chǎn)品;胰蛋白酶粉(Trypsin)、DMSO、MTT，Amresco公司產(chǎn)品;RNA酶，Sigma公司；P53、Ki67一抗，北京博奧森公司產(chǎn)品；即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒，均為武漢博士德生物工程有限公司;引物由上海生工生物工程公司合成;其余常規(guī)生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞對(duì)照組:不加任何處理因素。

中藥制備：陽和化巖湯組由鹿角霜12 g，淫羊藿9 g，白花蛇舌草12 g，山慈菇12 g，三棱9 g，莪術(shù)12 g，半夏9 g，浙貝9 g組成。制劑：加入10倍量的水在中藥中，提取揮發(fā)油6 h，將收集的揮發(fā)油另器保存?zhèn)溆?；將藥液濾過濃縮至1∶1.5(藥材：藥液)，加入乙醇使含醇量達(dá)到60%，靜置24 h后取上清液，沉淀部分離心，合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮為相對(duì)密度1.18(60 ℃)備用。另將揮發(fā)油與吐溫-80混勻，加入上述藥物提取液中，混勻，再加入蔗糖，山梨酸，調(diào)節(jié)pH值并用水調(diào)整濃度至0.84 g/mL。采用上述水提醇沉法制備各拆方組，溫陽組(鹿角霜12 g，淫羊藿9 g)0.21 g/mL、解毒組(白花蛇舌草12 g，山慈菇15 g)0.27 g/mL、活血組(三棱9 g，莪術(shù)12 g)0.21 g/mL、化痰組(半夏9 g，浙貝9 g)0.18 g/mL。他莫昔芬(TAM)制備：將其溶于生理鹽水，濃度為0.03 mg/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BB16uv/BB5060uv CO2培養(yǎng)箱，Heraeus公司產(chǎn)品；Axiovert 40倒置相差顯微鏡,德國(guó)蔡司公司產(chǎn)品；Elx50型洗板機(jī)、ELx808全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek公司產(chǎn)品；FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司產(chǎn)品；LAS-4000型化學(xué)發(fā)光及熒光影像分析儀，日本富士公司產(chǎn)品；sgavplus型超純水系統(tǒng)，法國(guó)Super-Q plus產(chǎn)品；ClassⅡ2085型超凈工作臺(tái)，美國(guó)Thermo Forma公司產(chǎn)品；DT5-3型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司產(chǎn)品；Veriti 96孔型梯度PCR儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法

2.1.1 細(xì)胞分組及造模方法

將MCF-10AT細(xì)胞消化吹打制成1×105/mL細(xì)胞懸液，在6孔板中進(jìn)行爬片，分為陽和化巖湯組、及拆方溫陽組、化痰組、活血組、解毒組、三苯氧胺組、空白對(duì)照組共7組，研究7組P53、Ki67蛋白表達(dá)差異。分別加入30%陽和化巖湯、溫陽組、化痰組、活血組、解毒組及他莫昔芬組藥物，濃度分別為0.84、0.21、0.18、0.21、0.27 g/mL、0.03 mg/mL；對(duì)照組加等量生理鹽水。7組共培養(yǎng)72 h 后按SABC 試劑盒說明書進(jìn)行染色，計(jì)算出灰度值陽性表達(dá)率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.1.2 結(jié)果判定方法

Ki67陽性細(xì)胞在細(xì)胞核表達(dá)棕黃色顆粒，P53陽性細(xì)胞在細(xì)胞核表達(dá)棕黃色顆粒。高倍鏡下選擇陽性細(xì)胞較多的區(qū)域采集3～5個(gè)光鏡視野，輸入到HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)內(nèi)，在相同的背底和倍體條件下選擇相應(yīng)的參數(shù)，進(jìn)行計(jì)算機(jī)完全定量分析。以陽性細(xì)胞所占比例的平均值定義為陽性細(xì)胞百分比，并將其作為陽性率評(píng)定依據(jù)，陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度用灰度值表示，著色強(qiáng)度越高，灰度值越低，反之，著色強(qiáng)度越低，則灰度值越高。

2.2 半定量RT-PCR法

采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA。取少量總RNA于紫外分光光度計(jì)下測(cè)定波長(zhǎng)260 nm和280 nm的吸光度比值，利用寡聚體DNA260計(jì)算RNA濃度，并稀釋至1 g/L。以反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因。

擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，52.5 ℃持續(xù)1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后1 個(gè)循環(huán)后72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存產(chǎn)物。取6 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，采用Kodak 1D型凝膠自動(dòng)成像分析系統(tǒng)分析凝膠電泳結(jié)果，計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)蛋白表達(dá)灰度值

3.1.1 免疫染色結(jié)果

空白對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中P53蛋白表達(dá)，呈陽性(+)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞P53蛋白弱表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，見圖1?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞核中Ki67蛋白強(qiáng)表達(dá)，呈陽性(+)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Ki67蛋白弱表達(dá)于細(xì)胞核，見圖1～2。

圖1 免疫組化法檢測(cè)P53蛋白表達(dá)情況(×400)

3.1.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)P53蛋白表達(dá)陽性率

P53蛋白表達(dá)見表2，陽和化巖湯組及三苯氧胺組與空白對(duì)照組比較，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；溫陽組、活血組、化痰組及解毒組與陽和化巖湯組相比，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 P53蛋白表達(dá)陽性率、Ki67蛋白表達(dá)灰度值

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Ki67蛋白表達(dá)情況(×400)

3.1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Ki67蛋白表達(dá)灰度值

Ki67蛋白表達(dá)灰度值見表2，陽和化巖湯組及三苯氧胺組與空白對(duì)照組比較，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；溫陽組、活血組、化痰組及解毒組與陽和化巖湯組相比P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.2 RT-PCR檢測(cè)P53、Ki67 mRNA表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)P53 mRNA相對(duì)表達(dá)見表3、圖3，陽和化巖湯組及三苯氧胺組與空白對(duì)照組比較(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；溫陽組、活血組、化痰組及解毒組與陽和化巖湯組相比(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 RT-PCR檢測(cè)P53 mRNA、Ki67 mRNA相對(duì)表達(dá)量

注:1.陽和化巖湯組;2.溫陽組;3.活血組;4.化痰組;5.解毒組;6.三苯氧胺組;7.空白對(duì)照組

RT-PCR檢測(cè)Ki67 mRNA結(jié)果見表3、圖4，陽和化巖湯組及三苯氧胺組與空白對(duì)照組比較P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；溫陽組、活血組、化痰組及解毒組與陽和化巖湯組相比P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

注:1.陽和化巖湯組;2.溫陽組;3.活血組;4.化痰組;5.解毒組;6.三苯氧胺組;7.空白對(duì)照組

4 討論

根據(jù)乳腺癌癌前病變的證候特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)，該病屬傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“乳癖”范疇[5]。其病因多與情志、飲食及勞倦等因素有關(guān)，導(dǎo)致肝氣郁結(jié)，痰瘀互結(jié)或沖任失調(diào)，阻于乳絡(luò)而發(fā)，出現(xiàn)雙側(cè)乳房疼痛、腫塊，并與月經(jīng)周期有關(guān)。裴曉華認(rèn)為本病“毒瘀互結(jié)”，可進(jìn)展為乳腺癌[6]。因此，本病可從溫腎助陽、化痰散結(jié)等方面進(jìn)行辨證治療。

目前，乳腺癌癌前病變的預(yù)防及治療主要采用溫陽法[7]。本實(shí)驗(yàn)采用的陽和化巖湯由清代高思敬《外科醫(yī)鏡》中的陽和化巖湯加減而成。方中鹿角霜、淫羊藿溫補(bǔ)腎陽，半夏、浙貝化痰散結(jié)，三棱、莪術(shù)行氣活血，山慈菇、白花蛇舌草清熱解毒，全方溫腎助陽與化痰散結(jié)并用，佐以行氣活血、清熱解毒，攻補(bǔ)兼施?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鹿角霜對(duì)大鼠乳腺增生有一定的治療作用[8]。淫羊藿苷具有抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7、MDA-MB-23l等作用[9]。半夏總生物堿對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖有一定抑制作用[10]。浙貝母總生物堿能夠抑制耐藥腫瘤細(xì)胞P-糖蛋白(P-gp)的外排活性,從而降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性[11]。三棱黃酮(RSF)能夠有效抑制乳腺癌MCF-7的細(xì)胞增殖[12]。李文靜[13]等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，莪術(shù)油能夠抗大鼠乳腺增生，與改善大鼠紊亂的激素水平有關(guān)，殷玉琨[14]等前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，莪術(shù)油對(duì)抑制大鼠乳腺癌癌前病變進(jìn)一步發(fā)展有一定治療作用。葉蘭[15]等實(shí)驗(yàn)研究證明，三棱與莪術(shù)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，可能與VEGF蛋白表達(dá)顯著下降有關(guān)。宋舟等實(shí)驗(yàn)研究表明，白花蛇舌草可降低血清中VEGF的含量[16-17]，山慈菇中的秋水仙堿、姜黃素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖以及誘導(dǎo)凋亡，干擾乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移及抗血管生成等作用[18]?，F(xiàn)代研究藥理學(xué)研究表明，溫陽化痰法能夠減緩乳腺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制癌變進(jìn)程[3]。

研究表明，細(xì)胞核內(nèi)蛋白Ki67抗原與乳腺癌的增殖與預(yù)后相關(guān)。Ki67是在細(xì)胞周期的活躍階段表達(dá)的一種增殖標(biāo)記[19]，在G1期和S期早期水平較低，在有絲分裂時(shí)達(dá)到峰值水平，在后期和末期，表達(dá)水平急劇下降，它在靜息階段G0期間不表達(dá)[20]。相關(guān)研究證實(shí)，Ki67在健康乳腺組織中低水平表達(dá)(<3%)[21]，Ki67的表達(dá)在從良性乳腺疾病到導(dǎo)管原位癌再到浸潤(rùn)性乳腺癌的整個(gè)過程中逐漸增加[22]。同時(shí)，Ki67與惡性腫瘤呈正相關(guān)，蛋白表達(dá)越高，癌細(xì)胞增殖活性越高，預(yù)后越差[23]。

P53是公認(rèn)的抑癌基因，位于人染色體17p13。它分為野生型與突變型，野生型P53可以參與DNA的修復(fù)，抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，與細(xì)胞周期、血管形成等多個(gè)方面有關(guān)，但不易被檢測(cè)到。研究表明，乳腺癌中P53發(fā)生突變的機(jī)率約為25%～30%[24]。突變型P53比野生型P53更穩(wěn)定[25]，突變的p53蛋白可以在攜帶突變基因的癌細(xì)胞中積累，許多腫瘤細(xì)胞核顯示出p53的強(qiáng)染色，而周圍正常組織中的細(xì)胞顯示出弱的或缺失的p53免疫反應(yīng)性[26]。突變型P53能夠誘導(dǎo)細(xì)胞癌變，加快癌細(xì)胞增殖，由于突變型半衰期延長(zhǎng)，更易被檢測(cè)到[27]。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫細(xì)胞化學(xué)法和半定量RT-PCR法檢測(cè)陽和化巖湯及拆方對(duì)Ki67、P53表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，陽和化巖湯及拆方均能降低Ki67、突變型P53的表達(dá)?，F(xiàn)代藥理研究表明，陽和化巖湯中的單味中藥對(duì)乳腺癌都有一定的抑制或治療作用，本實(shí)驗(yàn)證明，三苯氧胺與陽和化巖湯可減緩腫瘤細(xì)胞增殖活性，達(dá)到延緩乳腺癌進(jìn)一步發(fā)展的目的，其機(jī)制可能與降低Ki67、突變型P53的表達(dá)有關(guān)。拆方組對(duì)抑制或治療乳腺癌有一定療效，但溫陽化痰、活血解毒的陽和化巖湯療效更有優(yōu)勢(shì)，為臨床治療乳腺癌提供了更好的思路與方向。