伸筋草總生物堿的提取純化與急性毒性及抗炎活性研究

張妍妍，畢悅，尹麗穎，牛雯穎，肖洪彬

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

伸筋草為石松科植物石松LycopodiumjaponicumThunb.的干燥全草，在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，其味微苦、溫、辛，歸于肝、腎、脾經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)等功效[1]。伸筋草中含有豐富的生物堿類成分，還含有三萜類、黃酮類、揮發(fā)油等其他成分[2]，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抑制乙酰膽堿酯酶活性、抗血小板凝集、調(diào)節(jié)免疫及抗氧化作用等多重藥理作用[3-5]。多年來(lái)臨床實(shí)踐證實(shí)，伸筋草用于類風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生性膝關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎等的治療效果確切，然而關(guān)于伸筋草抗炎抗風(fēng)濕的藥物作用機(jī)制報(bào)道較少，且缺乏針對(duì)性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和毒理研究，影響了藥物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。本研究旨在對(duì)伸筋草總生物堿成分的急性毒性及抗炎活性進(jìn)行研究，為伸筋草藥用資源的有效充分利用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)藥品

伸筋草藥材由哈藥集團(tuán)世一堂中藥飲片有限責(zé)任公司提供，并經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心中藥形態(tài)實(shí)驗(yàn)室鑒定為石松科植物石松LycopodiumjaponicumThunb.的干燥全草?？鄥A對(duì)照品，購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110805-201709。雷公藤多苷片，購(gòu)自于遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，規(guī)格：10 mg/片，批號(hào)：20170301，用羧甲基纖維素鈉配制成雷公藤多苷-CMC混懸液2.5 mg/mL。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(黑)-2017-011， SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)-2018-0007，均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在(25±2)℃下飼養(yǎng)，光照12 h/12 h明暗自動(dòng)切換(7:00-19:00)，自由飲水采食，經(jīng)檢查判斷為健康后用于試驗(yàn)。

1.3 儀器及試劑

001x7型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(河北森納特化工有限公司)；Agilent 8453紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；IKA MVP 10基本型真空泵(艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司)；101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。弗氏完全佐劑(批號(hào)：1002036152，西格瑪公司)，水為雙蒸水，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 伸筋草總生物堿的提取純化與含量測(cè)定

2.1.1 伸筋草總生物堿的提取純化

采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法提取純化伸筋草中的總生物堿成分[6]。取伸筋草藥材500 g，烘干后粉碎成粗粉，加入0.2%的鹽酸溶液滲漉提取，滲漉液經(jīng)調(diào)pH值(pH=7.4)進(jìn)行梯度沉淀，過(guò)濾，濾液上001×7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，流速3 BV/h，水洗至流出液中性，用5%的氨水洗脫樹(shù)脂，洗脫液減壓回收至膏狀，烘干，即得伸筋草總生物堿提取物。

2.1.2 伸筋草總生物堿的含量測(cè)定

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取5 mg苦參堿對(duì)照品，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.05 mg的苦參堿對(duì)照品溶液。

樣品溶液的制備：精密稱取10 mg伸筋草總生物堿干燥提取物，置于10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，并定容至刻度，即得。

樣品中總生物堿含量的測(cè)定方法: 采用酸性染料比色法[7]，測(cè)定提取物中總生物堿的含量，精密量取樣品溶液3 份，每份0.5 mL，分別置于分液漏斗中，依次分別加入pH 4.0的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5 mL、三氯甲烷5 mL和溴甲酚綠溶液2 mL，振搖2 min，靜置分層，取三氯甲烷層，在425 nm處測(cè)定吸光度。

2.1.3 線性范圍考察

分別精密量取0.2、0.6、0.8、1.2、2.0 mL對(duì)照品溶液，置于分液漏斗中，同樣品溶液的處理方法，依次加入pH 4.0的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5 mL、三氯甲烷5 mL和溴甲酚綠溶液2 mL，振搖2 min，靜置分層，取三氯甲烷層，在425 nm處測(cè)定吸光度。不加對(duì)照品，以空白溶劑同法處理為空白對(duì)照，所得三氯甲烷溶液，在425 nm處測(cè)定吸光度。以苦參堿對(duì)照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

精密量取0.2 mL對(duì)照品溶液，同樣品溶液的處理方法，所得三氯甲烷待測(cè)液，在425 nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算吸光度的RSD值。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取樣品溶液6份，每份0.5 mL，同樣品溶液的處理方法，制得6份三氯甲烷待測(cè)液，在425 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算含量及RSD值。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取0.5 mL樣品溶液，同樣品溶液的處理方法，制得三氯甲烷待測(cè)液，室溫放置0、2、4、6、8 h時(shí)，分別在425 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算不同放置時(shí)間的RSD值。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取樣品溶液5份，每份0.5 mL， 分別加入0.2 mL對(duì)照品溶液，同樣品溶液的處理方法，制得三氯甲烷待測(cè)液，在425 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率及RSD值。

2.2 伸筋草總生物堿的急性毒性試驗(yàn)

取SPF級(jí)小鼠60只，隨機(jī)分為6個(gè)組，1組為正常對(duì)照組，其余5組為伸筋草總生物堿提取物不同劑量給藥組，每組均為10只，雌雄各半。參考預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置小鼠的5個(gè)給藥劑量分別為1.38、2.07、2.76、3.45、4.14 g/kg(以總生物堿提取物量計(jì))，給藥體積均為25 mL/kg。依次取相應(yīng)量的伸筋草總生物堿提取物溶于水，小鼠經(jīng)口一次性灌胃，正常對(duì)照組小鼠灌胃等體積生理鹽水，灌胃前12 h、灌胃后4 h均禁食，自由飲水，灌胃后連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠的毒性反應(yīng)和死亡情況，14 d后處死所有小鼠，肉眼觀察心、肝、脾、胃、腎等主要臟器的變化，如發(fā)現(xiàn)病變情況則需要進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)檢查。

2.3 伸筋草總生物堿的抗炎活性研究

2.3.1 弗氏完全佐劑致大鼠足跖腫脹試驗(yàn)

取SPF級(jí)SD大鼠60只，隨機(jī)分為6個(gè)組，分別為正常對(duì)照組、模型組、雷公藤多苷陽(yáng)性對(duì)照組(5.40 mg/kg)、伸筋草總生物堿提取物高劑量組(19.80 mg/kg)、伸筋草總生物堿提取物中劑量組(12.38 mg/kg)、伸筋草總生物堿提取物低劑量組(4.95 mg/kg)，每組均為10只，雌雄各半。正常對(duì)照組10只大鼠右后足跖皮下注射生理鹽水0.15 mL，其余各組大鼠同法皮下注射等量弗氏完全佐劑，誘導(dǎo)佐劑型關(guān)節(jié)炎(Adjuvant-induced arthritis，AA)大鼠模型[8]。于造模后第10 d，以手術(shù)線環(huán)繞右后足跖部相應(yīng)部位測(cè)量周長(zhǎng)。測(cè)量后開(kāi)始分組灌胃給藥，每日1次，給藥體積均為10 mL/kg，正常對(duì)照組和模型組同法給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥14 d。末次給藥后2 h，同法再次測(cè)量右后足跖部周長(zhǎng)，計(jì)算足跖腫脹改善率。足跖腫脹改善率(%)=(給藥前大鼠右后足跖部周長(zhǎng)-給藥后大鼠右后足跖部周長(zhǎng))/ 給藥前大鼠右后足跖部周長(zhǎng)。

2.3.2 大鼠棉球肉芽腫增生試驗(yàn)

取SPF級(jí)SD大鼠50只，除去正常對(duì)照組，其余分組和給藥劑量均同“2.3.1”項(xiàng)下方法。將各組大鼠以水合氯醛麻醉，在無(wú)菌條件下于腹股溝處植入一個(gè)50 mg的滅菌干棉球[9]，待大鼠當(dāng)天清醒后開(kāi)始灌胃給藥，每日1次，模型組同法給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥14 d。末次給藥后2 h，處死大鼠并取出棉球肉芽腫組織，置于60 ℃烘箱中，干燥24 h后取出稱重，即為棉球肉芽腫質(zhì)量。肉芽腫質(zhì)量=棉球肉芽腫質(zhì)量-原干棉球質(zhì)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理統(tǒng)計(jì)，對(duì)符合正態(tài)分布的多組間均值比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett'sT3法，數(shù)據(jù)結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，P<0.05顯示為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；急性毒性實(shí)驗(yàn)采用半數(shù)致死量(LD50)Bliss法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

3 結(jié)果

3.1 伸筋草總生物堿的提取純化與含量測(cè)定結(jié)果

500 g伸筋草藥材共提取純化制得伸筋草總生物堿提取物92 g，提取率為18.4%。所得苦參堿的線性回歸方程為：Y=396.68X+401.41(R2=0.999 2)，線性范圍為1.9～14.3 μg/mL，表明苦參堿對(duì)照品與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，苦參堿對(duì)照品連續(xù)測(cè)定5次吸光度的RSD值為0.86%，表明測(cè)定儀器的精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，同法制得的5份樣品待測(cè)液中的總生物堿含量分別為2.75、2.68、2.76、2.80、2.79 μg/mL，計(jì)算RSD值為1.71%，表明本試驗(yàn)所選的總生物堿樣品處理方法與含量測(cè)定方法的重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，樣品待測(cè)溶液在放置不同時(shí)間時(shí)測(cè)定的吸光度間的RSD值為0.92%，表明本試驗(yàn)方法制得的樣品待測(cè)溶液在室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，5份混合樣品待測(cè)溶液的平均加樣回收率為99.22%，RSD值為1.34%，表明本試驗(yàn)方法的加樣回收率良好。伸筋草總生物堿的含量測(cè)定結(jié)果顯示，所制得3份樣品待測(cè)液中總生物堿的平均含量為2.77 μg/mL，見(jiàn)表1。以平均含量計(jì)算得伸筋草提取物中所含總生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.47 μg/mg。

表1 伸筋草總生物堿的含量測(cè)定結(jié)果

3.2 伸筋草總生物堿的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

正常對(duì)照組小鼠均表現(xiàn)正常，未見(jiàn)死亡。試驗(yàn)小鼠在灌胃給藥后多表現(xiàn)為食欲減弱，活動(dòng)量減少，部分出現(xiàn)便溏現(xiàn)象，均在48 h內(nèi)恢復(fù)正常。1～3 d內(nèi)出現(xiàn)部分小鼠死亡，對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖，肉眼觀察心、肝、脾、胃、腎等主要臟器，未見(jiàn)明顯異常。3 d后未見(jiàn)繼續(xù)死亡情況，連續(xù)觀察14 d，存活情況良好，未出現(xiàn)其他毒性反應(yīng)。14 d后，處死所有試驗(yàn)小鼠并解剖，肉眼觀察心、肝、脾、胃、腎等主要臟器，未見(jiàn)明顯異常。統(tǒng)計(jì)不同劑量給藥組小鼠的死亡率，Bliss 法計(jì)算伸筋草總生物堿提取物的LD50為11.62 g/kg，見(jiàn)表2。

表2 伸筋草總生物堿的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

3.3 伸筋草總生物堿的抗炎活性研究結(jié)果

3.3.1 對(duì)弗氏完全佐劑致大鼠足跖腫脹的作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 伸筋草總生物堿對(duì)弗氏完全佐劑致大鼠足跖腫脹的作用

由表3可以看出，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠的足跖腫脹改善率顯著升高(P<0.05)，可見(jiàn)弗氏完全佐劑誘導(dǎo)AA大鼠模型成功；與模型組相比，伸筋草高、中、低劑量組均能夠改善AA大鼠模型的足跖腫脹情況，且呈現(xiàn)劑量依賴性，其中伸筋草高、中劑量組改善效果顯著(P<0.05)。

3.3.2 對(duì)大鼠棉球肉芽腫增生的作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可以看出，與模型組相比，伸筋草高、中、低劑量組均能夠降低大鼠棉球肉芽腫的增生情況，且呈現(xiàn)劑量依賴性，其中伸筋草高、中劑量組降低效果顯著(P<0.05)。

表4 伸筋草總生物堿對(duì)大鼠棉球肉芽腫增生的作用

4 討論

伸筋草又名舒筋草，中醫(yī)常用于治療關(guān)節(jié)腫痛、風(fēng)寒濕痹、筋脈拘急等癥。研究報(bào)道，伸筋草具有較強(qiáng)的抗炎、抗風(fēng)濕作用[10-11]，其抗炎活性物質(zhì)可能為藥材中富含的生物堿成分[12-13]，基于此，本研究對(duì)伸筋草藥材中的生物堿成分進(jìn)行了提取純化和抗炎活性研究，以進(jìn)一步驗(yàn)證伸筋草抗炎、抗風(fēng)濕的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床伸筋草藥物的應(yīng)用和抗炎抗風(fēng)濕藥物的開(kāi)發(fā)提供新的理論依據(jù)。

伸筋草中富含的生物堿成分主要為石松堿、石松定堿、石松靈堿等[2]。傳統(tǒng)的生物堿提取方法多為堿性乙醇提取，三氯甲烷萃取，方法操作繁瑣，且不適用于工業(yè)化生產(chǎn)[6]，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂近年來(lái)常被用于生物堿的提取純化，具有吸附容量大、裝置簡(jiǎn)單、易再生的優(yōu)點(diǎn)[14]，本研究采用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)伸筋草中的生物堿成分進(jìn)行提取，提取溶劑選擇極性較大的鹽酸水(濃度0.2%)，待藥物成分被陽(yáng)離子交換樹(shù)脂充分吸附后， 以堿性氨水洗脫，使生物堿成分在堿性環(huán)境下充分游離，大大提高了伸筋草總生物堿的得率[15]。由于伸筋草中的生物堿成分多無(wú)市售，故研究選擇與伸筋草中生物堿結(jié)構(gòu)相近的苦參堿做為對(duì)照品，對(duì)伸筋草提取物中的總生物堿含量進(jìn)行了測(cè)定，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.47 μg/mg的伸筋草提取物總生物堿成分。

本研究對(duì)伸筋草總生物堿提取物進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，部分試驗(yàn)小鼠在給藥后短期內(nèi)表現(xiàn)為食欲減弱、活動(dòng)量減少、便溏等輕微毒性反應(yīng)， 48 h內(nèi)即恢復(fù)正常。僅在1～3 d內(nèi)出現(xiàn)少量動(dòng)物死亡，3 d后未見(jiàn)新的動(dòng)物死亡，連續(xù)觀察14 d后，解剖可見(jiàn)心、肝、脾、胃、腎等主要臟器，未見(jiàn)明顯異常，Bliss法計(jì)算伸筋草總生物堿提取物的LD50為11.62 g/kg，遠(yuǎn)超于正常人的服用劑量，可見(jiàn)，伸筋草總生物堿提取物的毒性較小，臨床應(yīng)用安全可靠。研究以弗氏完全佐劑致大鼠足跖腫脹試驗(yàn)和大鼠棉球肉芽腫增生試驗(yàn)，對(duì)伸筋草總生物堿的抗炎活性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，伸筋草高、中、低劑量組均能夠改善佐劑型關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠的足跖腫脹并降低大鼠棉球肉芽腫的增生情況，且呈現(xiàn)劑量依賴性，即給藥劑量越大，抗炎效果越佳。其中伸筋草高、中劑量組與模型組相比，改善效果顯著(P<0.05)。

綜上可見(jiàn)，采用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂提取純化伸筋草中的生物堿成分，效果較佳，得到的伸筋草總生物堿提取物未見(jiàn)明顯毒性，并具有較好的抗炎作用。