甜柿炭疽病病原菌的鑒定及其防治藥劑的篩選

張 童, 姚立萍, 胡玉慈, 唐鑫彪, 何淑敏, 陳清西, 文志豐

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 福州 350018；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

柿(Diospyroskaki)是柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros)的一種溫帶經(jīng)濟林樹種.我國是柿的原產(chǎn)國，擁有世界上最悠久的柿樹栽培歷史，種植面積和柿果產(chǎn)量居世界之首[1- 2].柿具有較高的營養(yǎng)保健價值，果實中富含多酚、維生素等營養(yǎng)成分，具有清熱、潤肺、止血、降壓等功效.近年來，柿樹病害日益嚴(yán)重，主要有褐斑病、角斑病、黑斑病，炭疽病等[3-4].其中，柿炭疽病可危害葉、梢、花和果實等部位，導(dǎo)致樹勢衰弱、葉片干枯脫落、枝梢腐朽折斷、花腐、果腐，成為柿產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的限制因子[5].

目前已報道能侵染柿樹的炭疽菌種有尖孢炭疽復(fù)合種(theColletotrichumacutatumspecies complex)中的尖孢炭疽菌(C.acutatum)[6],膠孢炭疽復(fù)合種(theC.gloeosporioidesspecies complex)中的膠胞炭疽菌(C.gloeosporioides)、哈銳炭疽菌(C.horii)和暹羅炭疽菌(C.siamense)[7]，以及博寧炭疽復(fù)合種(TheC.boninensespecies complex)中的喀斯特炭疽菌(C.karstii)[8].Jeon et al[9]利用ITS、ACT、GADPH基因序列鑒定出哈銳炭疽菌為韓國柿炭疽病的致病菌；張敬澤等[10]揭示了柿炭疽病菌侵染過程中分生孢子的超微結(jié)構(gòu)及分生孢子從萌發(fā)到附著孢形成的過程；曲健祿等[11]測定了柿炭疽病菌膠孢炭疽菌的生物學(xué)特性以及7種殺菌劑對該菌的毒力作用；Lim et al[12]報道腈菌唑和戊唑醇可有效抑制柿炭疽??；Gang et al[13]測定了5種田間防治甜柿炭疽病常用藥劑的EC50值.但有關(guān)柿炭疽病菌分離鑒定及防治藥劑篩選的報道仍較少.

福建農(nóng)林大學(xué)果樹抗病與遺傳育種課題組在福建省莆田市仙游縣游洋鎮(zhèn)柿種植園調(diào)研時發(fā)現(xiàn)‘富有’甜柿葉片上出現(xiàn)大量不規(guī)則壞死斑，疑似炭疽病，嚴(yán)重影響甜柿的正常生長發(fā)育，給當(dāng)?shù)靥鹗廉a(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟和生態(tài)損失.本研究通過病樣采集、病原菌分離純化、形態(tài)學(xué)觀察、分子學(xué)分析及致病性檢測，確定引起該地區(qū)甜柿炭疽病的病原菌，并通過室內(nèi)毒力試驗測定6種田間常用藥劑對該病菌的抑制效果，以期為甜柿炭疽病的綜合防控提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集及供試藥劑

于2018年10月17日從福建省莆田市仙游縣游洋鎮(zhèn)柿種植園采集患有疑似炭疽病的‘富有’甜柿葉片，觀察并記錄發(fā)病癥狀.

抑菌試驗所用的藥劑(表1)均購自市場.

表1 試驗所用6種藥劑

1.2 病原菌的分離純化

參照方中達(dá)[14]的方法進(jìn)行病原菌的分離純化.選取發(fā)病葉片，無菌水清洗表面灰塵，在病斑與未發(fā)病交界處剪取6 mm×6 mm的矩形組織塊，在75%酒精中浸泡1 min，無菌水中漂洗1 min，接著在2%次氯酸鈉溶液中浸泡1 min，無菌水中漂洗1 min，然后用無菌濾紙吸干表面水分，置于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃、12 h光照/12 h黑暗條件下恒溫培養(yǎng).待組織塊在培養(yǎng)基上長出菌絲后，用無菌接種針挑取菌絲進(jìn)行分離培養(yǎng)，待其長出分生孢子后采用直接挑取法進(jìn)行單孢純化，獲得的純菌株置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，用已滅菌的打孔器在菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，接種到新的PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每株菌株做3次重復(fù)，7 d后觀察菌落顏色和形態(tài)，并測量菌落直徑，計算菌絲平均生長速率(mm·d-1).在倒置熒光顯微鏡(LEICADMI8)下觀察分生孢子形態(tài)，并隨機測量100個分生孢子大小.

1.4 病原菌的多基因分子分析與鑒定

將已純化的菌株接種到新的PDA培養(yǎng)基中，待菌絲長滿培養(yǎng)基，刮取適量菌絲體，利用真菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取病原菌基因組DNA，-20 ℃保存.用膠胞炭疽菌特異性引物(CgInt/ITS4)[15]、尖孢炭疽菌特異性引物(CaInt2/ITS4)[16]、核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spaces, ITS)引物(ITS1/ITS4)、β-微管蛋白(β-tublin gene, TUB2)引物(Bt2a/Bt2b)、鈣調(diào)蛋白(calmodulin gene, CAL)引物(CL1C/CL2C)和肌動蛋白(actin gene, ACT)引物(ACT-512F/ACT-783R)進(jìn)行PCR擴增[17-18].PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL.PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性90 s；94 ℃變性30 s，退火30 s(不同引物的退火溫度見表2)，72 ℃延伸1 min，共36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠純化試劑盒回收目的條帶，送至鉑尚生物技術(shù)(福州)有限公司測序.

表2 擴增甜柿炭疽病病原菌不同序列所用的引物

病原菌多基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：參考文獻(xiàn)[18-22]從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載模式菌株及已發(fā)表的菌株序列(表3)，利用ClustalX 1.81軟件處理4個保守基因ITS、TUB2、CAL和ACT序列組合數(shù)據(jù)，通過軟件MEGA 7.0將序列信息按ITS-TUB2-CAL-ACT的順序分別首尾相連，以最大簡約法構(gòu)建菌株的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，并利用自展法(bootstrap)進(jìn)行檢測，共循環(huán)1 000次.

表3 本研究中所用菌株的信息1)

1.5 病原菌致病性測定

將保存在4 ℃的菌株活化后轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)長至PDA培養(yǎng)皿的4/5左右，用已滅菌的打孔器打取直徑6 mm的菌餅和空白PDA培養(yǎng)基圓片.采用針刺法進(jìn)行回接試驗：選取無病斑、無損傷的甜柿葉片，經(jīng)75%酒精消毒后，用無菌接種針輕刺葉片，將菌餅貼于葉片傷口處，以接種空PDA培養(yǎng)基圓片的葉片為對照.將離體回接后的葉片平鋪于保鮮盒中，28 ℃、80%濕度條件下培養(yǎng)7～10 d，觀察并記錄葉片發(fā)病癥狀.再次對甜柿葉片發(fā)病部位的病原菌進(jìn)行分離純化，并比較其與原接種菌株的形態(tài)特征.

1.6 病原菌防治藥劑室內(nèi)篩選

1.6.1 菌絲生長抑制試驗 無菌條件下，將6種供試藥劑用無菌水配制成有效成分含量為10 000 mg·L-1的母液，吸取適量母液并用液體PDA稀釋至田間推薦使用濃度，配制成含藥PDA培養(yǎng)基.供試菌株培養(yǎng)7 d后，用已滅菌的打孔器打取直徑6 mm的菌餅，將菌餅接種于含不同藥劑的PDA培養(yǎng)基中央，以不含藥劑的PDA培養(yǎng)基為對照，每種藥劑做3次重復(fù).28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，每隔24 h觀察、記錄一次，至第7天采用十字交叉法測量各處理菌落直徑，并根據(jù)以下公式計算各藥劑的菌絲生長抑制率.

菌絲生長抑制率/%=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100

1.6.2 孢子萌發(fā)抑制試驗 吸取濃度約為1.0×106個·mL-1的孢子懸浮液和供試藥劑田間推薦使用濃度的2倍液各40 μL，充分混勻后滴于干凈的單凹載玻片上，以無菌水為對照，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)8 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察、統(tǒng)計各處理分生孢子萌發(fā)情況.每個處理鏡檢200～300個孢子，每種藥劑3次重復(fù)，根據(jù)以下公式計算孢子萌發(fā)抑制率.

孢子萌發(fā)抑制率/%=(對照孢子萌發(fā)數(shù)-處理孢子萌發(fā)數(shù))/對照孢子萌發(fā)數(shù)×100

試驗數(shù)據(jù)由 Microsoft Excel 2010、DPS數(shù)據(jù)處理平臺進(jìn)行統(tǒng)計分析.

1.7 部分供試藥劑的室內(nèi)毒力測定

選取抑菌效果好的4種藥劑做進(jìn)一步的毒力測定試驗，每種藥劑設(shè)置5個濃度(嘧菌酯:1 250、750、250、50、10 mg·L-1；波爾多液:2 400、1 200、600、300、150 mg·L-1；百菌清:1 600、800、400、200、100 mg·L-1；唑醚·代森聯(lián):2 500、1 250、625、250、125 mg·L-1)，制成含藥PDA培養(yǎng)基.供試菌株培養(yǎng)7 d后，用已滅菌的打孔器打取直徑6 mm的菌餅，接種于PDA培養(yǎng)基中央，菌絲面朝下，以不含藥劑的PDA培養(yǎng)基為對照，每種濃度做3次重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測量各處理菌落直徑，計算菌絲生長抑制率.

通過Microsoft Excel 2010、DPS數(shù)據(jù)處理平臺計算菌絲生長抑制率機率值與藥劑濃度對數(shù)值之間的線性回歸方程、各藥劑對甜柿炭疽菌的有效抑制中濃度(EC50)，比較該病原菌對各藥劑的敏感性.

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

柿炭疽病發(fā)病期長，從新葉形成一直持續(xù)到柿果采收.葉尖或葉緣處先發(fā)病，葉片正面出現(xiàn)褐色圓形或不規(guī)則形壞死斑(圖1A-B)，嚴(yán)重時連成片，造成葉片萎蔫干枯甚至脫落；葉片背面出現(xiàn)黑褐色點狀壞死斑(圖1C).

2.2 病原菌形態(tài)

本研究共分離獲得5株純化菌株，依次編號為FJXYTS-1、FJXYTS-2、FJXYTS-3、FJXYTS-4、FJXYTS-5. 5株菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落顏色、形態(tài)及菌絲生長速率無明顯差異：菌落近圓形，氣生菌絲絨毛狀，初期為白色，28 ℃、12 h光照/12 h黑暗恒溫培養(yǎng)7 d后，逐漸變?yōu)檩喖y狀、灰褐色(圖1D)；菌落背面有少量黑色素沉積，呈現(xiàn)不均勻的灰白色至灰褐色(圖1E)；菌絲生長速度較快，平均生長速率為11.6 mm·d-1.分生孢子圓柱形或長橢圓形，無色，單孢，兩端鈍圓或一端鈍圓略粗，另一端稍尖(圖1F)；少量分生孢子含1～2個油球(圖1G)，大小為(9.5～11.2) μm×(4.7～5.2) μm；分生孢子萌發(fā)時，一端細(xì)胞伸出芽管(圖1H)，芽管長度超過分生孢子直徑.

2.3 病原菌的多基因分子分析與鑒定

利用膠胞炭疽菌特異性引物(CgInt/ITS4)從5株供試菌株基因組DNA中均擴增出一條約500 bp的條帶(圖2A)，而利用尖孢炭疽菌特異性引物(CaInt2/ITS4)都未擴增出任何條帶(圖2B).進(jìn)一步利用ITS、TUB2、CAL和ACT引物對5株菌株進(jìn)行PCR擴增，都擴增出單一條帶(圖2C-F).測序結(jié)果顯示：從5株菌株中擴增所得到的序列一致，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定這5株菌株為同一種病原菌.將所得序列信息提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號:ITS為MN262115，TUB2為MN262118，CAL為MN262117，ACT為MN262116.

通過MEGA 7.0構(gòu)建ITS-TUB2-CAL-ACT多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，可以看出，供試菌株與已登錄的C.fructicola(ICMP18163)聚為一個分支，支持率為98%.結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將供試菌株鑒定為膠孢炭疽復(fù)合種中的果生刺盤孢(C.fructicola).

2.4 病原菌致病性

甜柿葉片在室內(nèi)接種分離菌株3 d后開始表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，接種部位出現(xiàn)褐色點狀病斑，接種5 d后病斑逐漸擴大為近圓形或不規(guī)則形，接種7 d后病斑進(jìn)一步擴大，且顏色變?yōu)楹诤稚?圖4B)，與田間癥狀相似；而對照組未發(fā)病(圖4A).對葉片發(fā)病部位的病菌進(jìn)行分離純化，所得菌株菌落顏色及分生孢子形態(tài)大小與原接種的菌株無明顯差異，符合柯赫氏法則，由此確定果生刺盤孢為甜柿炭疽病的致病菌.

2.5 病原菌防治藥劑篩選結(jié)果

除50%多菌靈外，其他5種供試藥劑對果生刺盤孢菌絲生長均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用(圖5).其中，75%百菌清1 000倍液對該菌菌絲生長的抑制作用最強，抑制率達(dá)71.64%(圖5G，表4)；60%唑醚·代森聯(lián)1 000倍液和25%嘧菌酯1 000倍液的抑制效果次之，抑制率分別為67.98%和63.30%(圖5F、5E，表4)；50%多菌靈1 000倍液的抑制效果最差，抑制率僅為0.27%，與清水對照無顯著差異(圖5B，表4).6種藥劑對果生刺盤孢分生孢子萌發(fā)的抑制效果均與對照差異顯著.其中，抑制效果較好的藥劑為75%百菌清和25%嘧菌酯，抑制率分別達(dá)85.69%和84.49%； 70%甲基硫菌靈對分生孢子萌發(fā)的抑制率最低(表4).綜上所述，抑制果生刺盤孢菌絲生長和孢子萌發(fā)的最佳藥劑為75%百菌清，可用于田間甜柿炭疽病的防控試驗.

表4 6種供試藥劑對果生刺盤孢菌絲生長與分生孢子萌發(fā)的抑制率1)

2.6 部分供試藥劑的室內(nèi)毒力

4種藥劑中，75%百菌清對果生刺盤孢的毒力最強，EC50值為27.44 mg·L-1；60%唑醚·代森聯(lián)和25%嘧菌酯毒力居中，EC50值分別為29.13和44.68 mg·L-1；80%波爾多液的毒力最差(表5).

表5 4種供試藥劑對果生刺盤孢的室內(nèi)毒力

3 討論

炭疽菌屬真菌是一類分布廣泛的植物病原菌類群，其形態(tài)學(xué)鑒定主要依據(jù)菌落形態(tài)、菌絲生長速率、分生孢子及附著孢的形態(tài)與大小.由于該屬真菌種類繁多，其形態(tài)特征易受培養(yǎng)條件影響而發(fā)生變異，不易進(jìn)行種間鑒定[23].目前，炭疽菌鑒定多采用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合多基因系統(tǒng)分析的方法，Hassan et al[24]采用形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS、ACT、GADPH等基因序列對韓國甜柿上的炭疽病菌進(jìn)行研究，鑒定出哈銳炭疽菌和暹羅炭疽菌.本研究通過形態(tài)學(xué)觀察、構(gòu)建多基因(ITS、TUB2、CAL、ACT)系統(tǒng)發(fā)育樹及致病性測定，將分離到的菌株鑒定為膠孢炭疽復(fù)合種中的果生刺盤孢(C.fructicola)，這是該菌侵染甜柿的首次報道.果生刺盤孢地理分布廣泛，寄主種類繁多，包括泰國的咖啡屬(Coffea)植物、德國的榕屬(Ficus)植物、日本的沙梨(Pyruspyrifolia)、美國的蘋果(Malusdomestica)和草莓(Fragaria×ananassa)及巴西的蘋果，還有茶樹(Camelliasinensis)、油茶(Camelliaoleifera)、芒果(Mangiferaindica)和辣椒(Capsicumannuum)等經(jīng)濟作物[25-28].

目前已有很多關(guān)于柿炭疽病防治藥劑篩選的報道.本次室內(nèi)毒力試驗結(jié)果顯示：百菌清對果生刺盤孢的防治效果最好，唑醚·代森聯(lián)和嘧菌酯防治效果次之，甲基硫菌靈和多菌靈幾乎無防治作用.這與余賢美等[29]報道柿樹炭疽菌對多菌靈敏感性低的結(jié)論一致.本試驗中的藥劑篩選是在室內(nèi)進(jìn)行，而室內(nèi)環(huán)境與田間環(huán)境存在較大差異，所以在推廣應(yīng)用之前，還需進(jìn)一步開展田間藥效試驗.