互花米草SaNAC36轉錄因子克隆及表達分析

王濤濤, 楊 勇, 魏 唯, 曾維科, 郭亞楠, 林辰濤, 馬留銀

(1.福建農林大學林學院；2.基礎林學與蛋白質組學研究中心；3.生命科學學院，福建 福州 350002)

互花米草(Spartinaalterniflora)是禾本科(Poaceae)、米草屬(Spartina)多年生草本植物，具有較強的耐鹽和繁殖能力，廣泛分布于我國多個省份的沿海流域.同時，作為典型的鹽生植物，互花米草在近年來受到科研人員的廣泛研究，盡管缺少參考基因組，研究人員利用轉錄組測序手段仍然挖掘出許多鹽脅迫調控相關的互花米草基因[1]，并且通過轉基因技術證明了互花米草基因可以作為水稻耐鹽改良的基因資源[2,3].

NAC家族蛋白是植物特有的轉錄因子，不僅調控植物的生長發(fā)育[4,5]，而且參與植物對非生物脅迫應答的調控過程[6].擬南芥NAC家族蛋白AtNAC2, AtNAC3和ANAC019通過調控脅迫相關基因的表達促進自身抵抗多種非生物脅迫[7-9]，水稻NAC095和NAC066蛋白在促進其耐寒和干旱脅迫中同樣具有重要的作用[10,11].NAC家族蛋白在N端含有1個保守的結構域，該結構域又被分為5個亞結構域(A-E)，NAC蛋白C端的結構多種多樣，從而發(fā)揮不同的轉錄激活功能[12].

AtNAC036作為擬南芥NAC家族成員之一，通過負向調控細胞的大小調控花莖器官的發(fā)育，在擬南芥中過表達AtNAC036基因導致植株長勢矮小[13]，表明AtNAC036是擬南芥生長的抑制子.為了探究互花米草NAC36轉錄因子的功能，本研究從互花米草三代全長轉錄組測序數據中獲得了擬南芥AtNAC036的同源基因SaNAC36，并對其蛋白結構域以及物種同源性進行了分析.為了分析基因和蛋白的表達特征，本研究利用qRT-PCR手段對SaNAC36在不同互花米草組織以及脅迫處理下的表達水平進行了檢測，同時在煙草(Nicotianatabacum)和酵母(Saccharomyce)中對SaNAC36蛋白的亞細胞定位和轉錄激活活性進行了驗證，并將SaNAC36基因過表達至擬南芥中以達到對SaNAC36轉錄因子功能的初步探究.

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用的互花米草種子和植株采自江蘇省贛榆市(E119°16′，N34°46′)，首先將互花米草種子置于濕潤的濾紙上萌發(fā)，1周后將萌發(fā)的幼苗轉入1/2 Hoagland(pH 8.0)營養(yǎng)液中避光培養(yǎng)3～4周，生長條件設定為16 h光照(26 ℃)，8 h黑暗(16 ℃)，期間每隔3 d更換1次營養(yǎng)液.進行鹽和ABA脅迫處理時，分別將互花米草幼苗培養(yǎng)在含有800 mmol·L-1NaCl和100 μmol·L-1ABA的營養(yǎng)液中；進行干旱脅迫處理時，將互花米草幼苗平鋪于干燥的濾紙上.所有處理均在第0、1、8和24 h時間點進行取樣，并將樣本用錫箔紙包裹且立即凍于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 生物信息學分析

通過與互花米草全長轉錄組數據庫(http://plantpolya.org/SAPacBio/)進行比對獲得擬南芥AtNAC36同源基因序列，進一步通過ORF預測(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)獲得SaNAC36基因編碼的氨基酸序列；在ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)上對蛋白的氨基酸數量、分子量以及等電點進行預測；利用NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)獲得SaNAC36蛋白在其它植物中的同源序列，并使用DNAman軟件進行蛋白序列比對并利用MEGA7軟件繪制物種之間的同源進化樹.

1.3 cDNA合成

用試劑盒(美基生物, 貨號R4151-02)提取互花米草幼苗和不同組織的總RNA，具體操作參照說明書進行，對RNA進行定性定量檢測確保其質量滿足后續(xù)試驗.取1 μg總RNA，然后利用MonScriptTMRTIII All-in-One Mix反轉錄試劑盒(莫納生物，貨號RN05004M)合成第一鏈cDNA，在每個反轉錄體系中加入1 μL的DNase I用于去除RNA中殘留的DNA，反應程序為：37 ℃，2 min；55 ℃，15 min；85 ℃，10 s，將cDNA濃度稀釋至5 ng·μL-1后低溫存儲備用.

1.4 RT-PCR和qRT-PCR試驗

RT-PCR和qRT-PCR試驗所需引物序列如表1所示，以合成的cDNA作為模板，使用高保真PCR酶進行RT-PCR擴增.25 μL反應體系包含：5 μL 5×PrimeSTAR GXL Buffer、2 μL dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)、0.5 μL正/反向引物(10 μmol·L-1)、1 μL cDNA、0.5 μL Prime STAR GXL DNA Polymerase(TaKaRa公司，貨號R050Q)和8 μL RNAse-free水.反應程序：98 ℃，1 min；98 ℃，10 s，60 ℃，15 s，68 ℃，1 kb·min-1；68 ℃，7 min，擴增30個循環(huán).

每個qRT-PCR反應體系包含10 μL SYBRGreen Master Mix(莫納生物，RN04002M)、1 μL正/反向引物(10 μmol·L-1)、1 μL cDNA模板和7 μL RNAse-free水.反應程序為95 ℃，5 min；95 ℃，10 s，60 ℃，10 s，72 ℃，30 s；72 ℃，5 min，擴增40個循環(huán).引物GC含量保證在40%～60%且TM值在55～65 ℃之間.樣本之間的表達量差異使用t-test進行計算，P值小于0.05定義為樣本之間具有顯著性差異.

1.5 煙草瞬時表達

利用特異性引物(表1)從互花米草cDNA中擴增出SaNAC36基因全長CDS序列，將純化后的PCR產物連接到植物表達載體pCambia3301上GFP標簽的N端，并隨后將載體借助農桿菌AGL0轉入煙草葉片中.煙草瞬時轉化試驗步驟主要包括：將200 μL陽性農桿菌菌液接入50 mL含有10 mmol·L-1MES、20 μmol·L-1乙酰丁香酮、50 mg·L-1卡那霉素以及50 mg·L-1利福平的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng).第2天，把菌液低速(4 000 r·min-1)離心15 min后用重懸液(10 mmol·L-1MES、150 μmol·L-1乙酰丁香酮、10 mmol·L-1MgCl2)混勻，并調D600 nm值至1.0～1.5之間.待重懸的菌液于室溫放置2 h后用無菌注射器注射入新鮮的煙草葉片中，同時對注射位置進行標記，將浸染后的煙草避光培養(yǎng)過夜，第2天取出放置于溫室繼續(xù)生長2 d.進行顯微觀察時，提前取小塊注射位置的煙草葉片于1 mg·L-1的DAPI染液中浸泡30 min，在倒置顯微鏡(Zeiss Axio Observer.A1)下分別觀察SaNAC36以及對照蛋白在明場(bright field)、GFP和DAPI通道下的表達情況.

表1 本研究所需的引物序列1)

1.6 轉錄自激活試驗

將SaNAC36基因全長CDS序列構建到酵母表達載體pGBKT7上SmaⅠ位點處，酵母菌感受態(tài)的制備和轉化步驟參考酵母雙雜手冊(https://www.takarabio.com/).把含有VP16基因的pGBKT7載體和空載體分別作為正、負對照，將目的載體和正、負對照載體同時轉入Y2HGold酵母菌中，并分別培養(yǎng)在缺少色氨酸(-Trp)的SD培養(yǎng)基上，30 ℃生長3 d后，從板上挑取單克隆搖菌，分別稀釋10倍和50倍后重新培養(yǎng)在正常和添加40 μg·mL-1X-α-gal的SD缺陷培養(yǎng)基上.

1.7 在擬南芥中過表達SaNAC36基因

采用農桿菌介導的花絮浸染法將先前構建好的植物表達載體pCambia3301轉化到rdr6-11背景的模式植物擬南芥中，詳細的轉化方案參考之前的研究[14].使用Basta(1∶1 000)對T1代轉基因苗進行篩選，并對存活的幼苗做進一步鑒定.將轉基因陽性苗繼續(xù)播種至T3代，純合的株系用于后續(xù)的表型觀察與分析.

2 結果與分析

2.1 互花米草SaNAC36基因的序列分析

以互花米草三代全長轉錄組數據庫為參考，通過比對獲得與擬南芥AtNAC036同源的互花米草基因SaNAC36(Cluster28982-001).對SaNAC36基因的全長轉錄本進行ORF預測，其全長CDS為942 bp，編碼313個氨基酸(圖1).蛋白預測結果顯示SaNAC36蛋白分子量約為35.2 ku，等電點為6.72.對SaNAC36基因全長CDS進行RT-PCR擴增進一步證明對SaNAC36轉錄本ORF的預測是正確的(圖2).

2.2 互花米草SaNAC36蛋白序列與進化分析

利用互花米草SaNAC36蛋白序列在NCBI比對獲得了水稻、玉米、高粱等物種的同源蛋白序列.比較互花米草、玉米、高粱、水稻和擬南芥的NAC36蛋白序列，發(fā)現它們在N端都含有保守的NAC結構域(A-E)(圖3).進一步將互花米草與其它13種植物的NAC36蛋白構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現互花米草與擬南芥NAC36蛋白同源性較高(圖4).

2.3 互花米草SaNAC36基因的表達分析

為了探究SaNAC36因子與互花米草生長發(fā)育及脅迫應答之間的關系，本研究通過qRT-PCR對SaNAC36基因的表達量進行了分析.首先通過檢測SaNAC36在互花米草不同組織中的表達量，結果表明，SaNAC36在葉片中表達量最高，相反在莖稈部分的表達量卻較低(圖5A).隨后分別檢測SaNAC36基因在鹽、ABA以及干旱處理下互花米草幼苗根部中的表達變化，在3種脅迫條件下，SaNAC36基因的表達量均趨于下調，在NaCl處理8 h和ABA處理1 h時，SaNAC36表達量降至最低，而在干旱處理8 h時，SaNAC36表達量雖有些許回升的趨勢，但表達量總體隨著處理時間的增加而降低(圖5B-D).這些結果表明，SaNAC36基因不僅具有組織表達差異性，同時也受到非生物脅迫的調控.

2.4 SaNAC36蛋白的亞細胞定位與轉錄自激活分析

轉錄因子通常在細胞核內發(fā)揮功能，為了驗證互花米草SaNAC36蛋白是否具有轉錄因子功能，本研究首先在煙草葉片中檢測SaNAC36蛋白的亞細胞定位情況.借助農桿菌將帶有SaNAC36基因的表達載體瞬時轉入煙草葉片中，然后通過對煙草葉片所表達熒光及細胞核顯色位置的觀察清楚地發(fā)現SaNAC36蛋白在煙草葉片表皮細胞的細胞核中表達(圖6A).在酵母自激活試驗中，轉入pGBKT7-SaNAC36載體的酵母菌與轉入正對照pGBKT7-VP16的結果相同，不僅可以生長在缺少Trp的SD培養(yǎng)基上，而且在含有X-α-gal的缺陷培養(yǎng)基上菌斑呈藍色，然而轉入pGBKT7的負對照菌斑卻沒有變藍(圖6B).這些結果共同表明SaNAC36蛋白具有轉錄激活活性，可能發(fā)揮轉錄因子功能.

2.5 在擬南芥中過表達SaNAC36基因產生植株矮小表型

為了進一步驗證SaNAC36轉錄因子的功能，本研究將SaNAC36基因過表達至模式植物擬南芥中.通過Basta抗性篩選以及RT-PCR鑒定后得到表達成功的轉基因株系8和9(圖7A).對轉基因株系的qRT-PCR試驗證明，SaNAC36在過表達植株里的表達量顯著高于對照組植株(圖7B).對T3代轉基因株系表型的觀察發(fā)現，株系9擬南芥的長勢明顯弱于對照植株(圖7C)，包括植株高度和果莢長度在內的一些生長受到顯著抑制(圖7D)，說明SaNAC36轉錄因子可能參與調控植物的生長發(fā)育.

3 討論

NAC家族轉錄因子是植物特有且重要的調控因子，研究互花米草NAC蛋白功能對探索NAC轉錄因子與互花米草生長發(fā)育之間的關系具有重要意義.本研究在互花米草全長轉錄組中鑒定出NAC家族轉錄因子SaNAC36，并從序列比對、同源進化樹、亞細胞定位、轉錄激活活性、基因表達以及轉基因植株表型等方面對其進行分析.序列比對和系統(tǒng)進化樹結果表明，互花米草與水稻、高粱、玉米以及擬南芥NAC36蛋白序列相似度很高，且在N端都含有保守的NAC結構域[12]，說明NAC36蛋白在植物中具有高度的同源性.亞細胞定位和轉錄自激活試驗進一步證明了SaNAC36蛋白具有轉錄激活活性，更加表明SaNAC36具有發(fā)揮植物NAC36轉錄因子功能的基礎.

基因差異表達是真核生物主要的調控方式，分析基因差異表達不僅可以研究基因在植物不同組織發(fā)育中的功能，同時也有助于探究基因在脅迫應答時的調控作用[16].本研究表明，SaNAC36基因在互花米草葉片中表達量較高，說明SaNAC36可能參與互花米草葉片生長發(fā)育的調控.與正向調控往往相反，參與負向調控的基因往往對植物的生長發(fā)育起抑制作用，當植物響應外界脅迫時，這類基因更傾向于降低自身的表達量[17,18]，研究表明，在高鹽、ABA和干旱脅迫下，SaNAC36基因的表達均呈下調的趨勢，說明SaNAC36因子在互花米草耐脅迫過程中可能主要起到負向調控的作用.

系統(tǒng)進化樹分析表明，SaNAC36與擬南芥AtNAC036蛋白同源性最高，SaNAC36可能具有與AtNAC036相似的功能，因此本研究選擇將SaNAC36基因克隆到擬南芥中以檢測其是否能產生與AtNAC36轉基因植株類似的表型[13].通過觀察發(fā)現，過表達SaNAC36基因的擬南芥植株相比對照組植株更加矮小，包括植株高度和果莢長度在內的一些生長特征均受到抑制，說明互花米草SaNAC36因子同樣具有負向調控細胞大小的功能.作為互花米草NAC家族成員之一，SaNAC36轉錄因子不僅具有保守的結構域，同時作為核定位的轉錄因子，具有與擬南芥AtNAC36蛋白相似的功能，不僅參與互花米草組織的生長發(fā)育，同時也參與互花米草響應非生物脅迫的負調控過程中.