喜樹堿與10-羥基喜樹堿對5種植物的化感作用

范曉月, 何云核, 趙富榮, 郭 明,3

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林與建筑學(xué)院;2.林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院;3.理學(xué)院， 浙江 杭州 311300)

目前植物功能的開發(fā)多是基于美化環(huán)境的作用，相關(guān)研究工作也多是從視覺景觀上加以考慮.而有些植物本身所釋放的化學(xué)物質(zhì)具有抑制周邊植物生長的現(xiàn)象，即化感作用[1].因此，人們在注重觀賞植物視覺效果的同時，開始將植物間的相互作用納入園林觀賞植物的生態(tài)應(yīng)用配置中，使得植物的視覺景觀感受與系統(tǒng)正常高效運行完美結(jié)合在園林綠化中.然而，雖然植物化感作用在農(nóng)作物、雜草、藻類控制以及外來入侵物種等方面取得不少研究成果[2,3]，但在植物應(yīng)用配置中的化感作用研究還不夠全面.植物生態(tài)系統(tǒng)中，化感作用主要表現(xiàn)為植物對自然資源和生存空間的競爭，能夠直接影響到系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和經(jīng)濟效益的實現(xiàn)[4].張淑珍等[5]研究表明，香樟對多種草坪草存在化感作用；Liu et al[6]研究表明，白樺、落葉松對其它植物種子萌發(fā)和苗生長具有化感作用；Chen et al[7]研究表明，杉木能夠分泌化感物質(zhì).喜樹(Camptothecaacuminata)為藍(lán)果樹科喜樹屬植物，是我國特有樹種.喜樹干形通直、樹姿優(yōu)美， 具有很高的觀賞價值，適用于庭院綠化、城市綠地等[8,9]，是集觀賞價值與藥用價值于一體的園林植物，在生態(tài)景觀植物配置中占有一定的地位.研究表明，喜樹的主要化學(xué)成分之一是生物堿類物質(zhì)[10,11]，具有一定的生物活性和化感作用，對多種人癌細(xì)胞株的生長有明顯的抑制作用[12-16]，但在植物效應(yīng)方面的研究尚未見報道，而研究植物化感物質(zhì)對其它植物種子萌發(fā)及植株生長的影響有著重要的生態(tài)意義和廣闊的應(yīng)用前景[17].

現(xiàn)有研究中，植物化感作用的生理指標(biāo)有葉片相對含水量(RWC)、葉片相對電導(dǎo)率、光合色素、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白(SP)和可溶性糖等，生長指標(biāo)有發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)(GI)、活力指數(shù)、幼苗苗高、幼苗根長、幼苗鮮重和葉面積等，光合熒光指標(biāo)有光響應(yīng)曲線、光合氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等.本研究以白車軸草(Trifoliumrepens)、大吳風(fēng)草(Farfugiumjaponicum)、三色堇(Violatricolor)、麥冬(Ophiopogonjaponicus)和鳶尾(Iristectorum)5種常見草本觀賞植物為試材，探討喜樹堿與10-羥基喜樹堿混合物對5種草本觀賞植物種子萌發(fā)和幼苗生長生理指標(biāo)的影響，從而了解喜樹的化感效應(yīng)及生理生化機制，為喬木與草本植物在園林景觀中的合理配置提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

受體植物來自浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)，選取長勢一致、無病蟲害的白車軸草、大吳風(fēng)草 、三色堇、麥冬和鳶尾 5種草本觀賞植物，移植于溫室大棚，至植物經(jīng)過緩苗期后開始試驗，5種植物種子購自杭州萬年青種業(yè)公司.

喜樹堿與10-羥基喜樹堿均購自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司，純度99%.因兩種物質(zhì)均難溶于水，所以先將喜樹堿與10-羥基喜樹堿分別溶于少量的酒精，最后配成酒精含量為0.5%(體積分?jǐn)?shù))的溶液，按1∶1的體積混合處理5種植物，以含有0.5%酒精的蒸餾水為對照CK0.5，不含酒精的蒸餾水為對照CK0，5 mg·L-1濃度為處理1(T1)，10 mg·L-1濃度為處理2(T2)，20 mg·L-1濃度為處理3(T3)，40 mg·L-1濃度為處理4(T4)，均用蒸餾水配置試驗所需溶液.

1.2 試驗方法

采用培養(yǎng)皿種子萌發(fā)試驗和盆栽試驗，檢測相關(guān)生長和生理指標(biāo)，研究化感物質(zhì)對5種草本植物的作用，從而考察5種植物對喜樹堿與10-羥基喜樹堿的耐受性.

1.2.1 種子萌發(fā)試驗 種子萌發(fā)試驗采用培養(yǎng)皿濾紙法，選取飽滿、狀態(tài)一致的種子，0.5% H2O2溶液消毒5 min，無菌蒸餾水清洗5次，吹干備用.在滅菌過的鋪有兩層定性濾紙的培養(yǎng)皿中，分別加入5 mL不同濃度的喜樹堿和10-羥基喜樹堿混合液(1∶1混合)，對照加等量無菌蒸餾水和含0.5%酒精的溶液.每個培養(yǎng)皿中播種50粒種子，各處理設(shè)置3次重復(fù)，置于25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng).播種24 h后開始記錄發(fā)芽數(shù)(以胚根沖破種皮1～2 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))，每天定時觀察并記錄發(fā)芽種子的數(shù)量，直至對照組種子的發(fā)芽數(shù)不再變化為止，計算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù).

發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)計算公式如下，計算結(jié)果見表1.

表1 CPT和HCPT對5種受體植物種子萌發(fā)的影響1)

發(fā)芽率(GP)=(種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%

(1)

發(fā)芽指數(shù)(Gi)=∑Gt/Dt

(2)

其中，Gt為在第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的天數(shù).

化感效應(yīng)指數(shù)(RI)=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T

綜合化感效應(yīng)指數(shù)(SE):供體植物對同一受體植物各個測試指標(biāo)的RI的算術(shù)平均值[18].

1.2.2 幼苗生長試驗 試驗植物為長勢大體一致的幼苗，種植于口徑18 cm，高16 cm，底徑13 cm的花盆里，用喜樹堿與10-羥基喜樹堿混合溶液(1∶1)處理5種植物，每個處理重復(fù)3次，每次共用200 mL混合液處理，每5 d處理1次，45 d后測定植物的相關(guān)生理指標(biāo)，包括葉片相對電導(dǎo)率、葉綠素(Chl)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)和可溶性蛋白(SP).試驗材料均于相同時間點取樣，樣品當(dāng)天處理分析完畢.

植物相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)法測定，葉綠素含量采用浸提法測定，SOD酶活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定，POD 酶活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，CAT活性采用紫外分光光度計測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定，脯氨酸含量采用茚三酮溶液顯色法測定，SP含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定[19].

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并經(jīng)GraphPad、SPSS 16.0統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 化感物質(zhì)對5種植物發(fā)芽率的影響

統(tǒng)計種子萌發(fā)數(shù)、發(fā)芽指數(shù)和根長，根據(jù)CK0.5計算RI值，CK0僅作參考(表1).含有0.5%酒精的處理對植物種子萌發(fā)、發(fā)芽指數(shù)和根長的影響較小，基本可以忽略，而加了化感物質(zhì)的處理液對種子萌發(fā)的抑制作用較強，進(jìn)而可能會導(dǎo)致植株根系變小，吸水、吸肥能力降低.在5種受體植物中，種子萌發(fā)率的化感抑制作用隨化感物質(zhì)濃度增高而逐漸增強，具有劑量效應(yīng)，但增幅不一致，其中不同濃度的化感物質(zhì)在白車軸草、三色堇和鳶尾根系和種子萌發(fā)中抑制作用較明顯(P<0.05)，在另外兩種植物中抑制作用不顯著.結(jié)合圖1分析可知，化感綜合效應(yīng)敏感度為：白車軸草>三色堇>鳶尾>大吳風(fēng)草>麥冬.

2.2 化感物質(zhì)對5種植物葉片相對電導(dǎo)率的影響

種子萌發(fā)試驗表明，含有0.5%酒精的處理對植物的影響可忽略，因而在植物生長指標(biāo)中，將含有0.5%的酒精處理作為對照.葉片電導(dǎo)率可反映植物受傷害的程度，可用來分析植物的抗逆性強弱[20].

不同濃度的喜樹堿與10-羥基喜樹堿混合溶液處理后，植物葉片相對電導(dǎo)率隨著藥物濃度的增高顯著大于CK0.5(圖2).其中，麥冬、三色堇、鳶尾、白車軸草和大吳風(fēng)草植物葉片相對電導(dǎo)率分別比CK0.5提高86.0%、78.1%、76.0%、56.2%和34.9%，表明化感物質(zhì)對5種植物葉片細(xì)胞膜具有較高的損害，植物葉片細(xì)胞電解質(zhì)外滲，使得細(xì)胞內(nèi)外滲透壓不平衡.

2.3 化感物質(zhì)對5種植物葉片MDA含量的影響

檢測結(jié)果表明，隨著化感物質(zhì)濃度的增高，植物葉片MDA含量呈上升趨勢(圖3)，且顯著高于CK0.5(P<0.05)，麥冬、三色堇、白車軸草、鳶尾和大吳風(fēng)草相較于CK0.5增幅分別為：285.7%、241.7%、183.3%、168.8%和118.2%.說明植物葉片細(xì)胞膜在喜樹堿與10-羥基喜樹堿共同作用下受到氧化作用，使膜脂過氧化終產(chǎn)物MDA大量積累，進(jìn)而導(dǎo)致植物代謝紊亂.

2.4 化感物質(zhì)對5種植物光合色素的影響

葉綠素(Chl)和類胡蘿卜素(Car)是植物光合作用的主要色素，在植物體內(nèi)的含量與植物光合作用效率密切相關(guān).5種植物受到化感作用時，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和葉綠素a+b含量的變化趨勢相同(表2).其中，白車軸草、三色堇、麥冬、鳶尾和大吳風(fēng)草的葉綠素a+b含量相較于CK0.5降幅分別為81.9%、77.3%、79.7%、61.1%和28.5%(P<0.05)，類胡蘿卜素含量相較于CK0.5降幅分別為68.8%、68.3%、75%、48.8%和27.0%.以上結(jié)果表明，植物在化感作用下，葉綠體結(jié)構(gòu)受損，葉綠素和類胡蘿卜素大量分解，其原因可能是化感物質(zhì)進(jìn)入受體植物幼苗體內(nèi)抑制了ATP酶的活性，使葉綠素合成的酶系統(tǒng)受到影響，也可能是化感物質(zhì)引起植物體內(nèi)活性氧的增加，致使葉綠素結(jié)構(gòu)遭到破壞而趨向分解[21]，影響植物光合作用有效進(jìn)行，最終降低植物配置的生態(tài)效益.

表2 化感物質(zhì)對植物葉片光合色素的影響1)

2.5 化感物質(zhì)對5種植物葉片SOD活性的影響

5種植物葉片的SOD活性隨化感物質(zhì)濃度的增高呈先上升后下降的趨勢(圖4).5種植物在作用濃度為10 mg·L-1時，SOD活性達(dá)到最大，其中有4種植物葉片的SOD最大活性均顯著高于CK0.5(P<0.05)，鳶尾、三色堇、大吳風(fēng)草和麥冬分別比CK0.5增高81.2%、56.4%、50.0%和27.5%，而白車軸草最大活性只比CK0.5高8.5%，表明化感作用促進(jìn)了植物的SOD活性.根據(jù)SOD活性變化可以看出，5種植物受化感物質(zhì)作用濃度影響顯示出不同程度的變化，并在化感物質(zhì)作用濃度超過10 mg·L-1后，所有植物的SOD活性均下降，這可能是因為5種草本植物受到的脅迫已超出自身抗氧化系統(tǒng)的極限，導(dǎo)致保護(hù)酶活性均降低.

2.6 化感物質(zhì)對5種植物葉片POD活性的影響

5種植物葉片的POD活性隨化感物質(zhì)濃度的增高呈先上升后下降的趨勢(圖5).處理濃度為10 mg·L-1時，POD活性達(dá)到最大值，植物的最大POD活性顯著高于CK0.5，三色堇、麥冬、鳶尾、大吳風(fēng)草、白車軸草分別為CK0.5的174.4%、169.5%、168.5%、159.2%、136.6%.由此可見，化感作用能顯著促進(jìn)植物的POD活性.但化感物質(zhì)濃度超過10 mg·L-1時，POD活性開始顯著下降，說明植物的抗氧化系統(tǒng)是有一定限度的.

2.7 化感物質(zhì)對5種植物葉片CAT活性的影響

5種植物葉片的CAT活性隨化感物質(zhì)濃度的增高呈先上升后下降的趨勢(圖6).同SOD、POD活性的檢測結(jié)果相似，5種植物的CAT活性均在10 mg·L-1時達(dá)到最大值，最高CAT活性顯著高于CK0.5，三色堇、大吳風(fēng)草、鳶尾、麥冬、白車軸草分別為CK0.5的178.6%、169.7%、168.7%、167.7%和150.1%.表明化感物質(zhì)作用后促進(jìn)了CAT的活性，使得植物在逆境時啟動自身防御系統(tǒng)，釋放多種成分.本試驗中，5種植物在受到10 mg·L-1化感物質(zhì)作用時，CAT、SOD、POD活性達(dá)到最高值，保護(hù)植物在逆境條件下免受傷害，但研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)化感作用超過這一濃度時，保護(hù)酶活性降低[22].

2.8 化感物質(zhì)對5種植物葉片可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白(SP)在各種酶類代謝中起調(diào)控和促進(jìn)作用，5種植物葉片可溶性蛋白含量隨化感物質(zhì)濃度的增高呈先上升后下降的趨勢(圖7).植物可溶性蛋白在0～20 mg·L-1范圍內(nèi)隨著化感物質(zhì)濃度的增高而不斷累積，三色堇、鳶尾、大吳風(fēng)草、白車軸草、麥冬分別為CK0.5的671.6%、440.4%、339.5%、222.9%和62.6%.而當(dāng)濃度超過20 mg·L-1時，植物葉片萎蔫嚴(yán)重，蛋白質(zhì)累積量小于分解量，含量開始下降.

2.9 化感物質(zhì)對5種植物葉片脯氨酸含量的影響

逆境條件下，抗性越強的植物脯氨酸含量變化幅度越大(圖8).5種植物的脯氨酸含量呈上升趨勢，大吳風(fēng)草和三色堇的脯氨酸含量在化感物質(zhì)濃度超過10 mg·L-1時急劇上升，最高含量約為CK0.5的5.48倍和5.32倍.鳶尾、麥冬、白車軸草3種植物的最高脯氨酸含量約為CK0.5的1.78倍、2.74倍、3.78倍.可見，5種植物在化感作用中根據(jù)自身條件產(chǎn)生脯氨酸進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，并發(fā)揮重要作用.

3 討論

植物化感作用是自然界中普遍存在的一種生態(tài)機制[23]，影響受體植物在群落中的多度及競爭力[24,25]，因此，熟悉植物之間的生態(tài)習(xí)性，正確利用植物之間的化感作用，在水平方向上進(jìn)行合理的園林植物配置(即平面上種植點的確定)，可以構(gòu)建一個具有藝術(shù)美的生態(tài)園林.本試驗中，白車軸草、大吳風(fēng)草、三色堇、麥冬和鳶尾是南方園林綠化中常用的草本觀賞植物.通過檢測5種植物化感作用后的種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)和根長的變化，以及檢測生理指標(biāo)(光合色素、電導(dǎo)率、MDA、POD、SOD、CAT、脯氨酸和可溶性蛋白)的變化，在種子萌發(fā)和幼苗生長方面全面研究喜樹堿與10-羥基喜樹堿對這5種植物的化感作用，注重植物在水平方向上近期效果與遠(yuǎn)期效果的結(jié)合，可使得植物的生態(tài)效益最大化.

本研究顯分析上述各項檢測指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)喜樹堿與10-羥基喜樹堿對5種植物的作用主要表現(xiàn)為對幼苗生長和種子萌發(fā)過程中各項指標(biāo)產(chǎn)生或多或少的影響，從而表現(xiàn)出化感作用，且不同植物受到的影響程度不同.

化感物質(zhì)在一定程度上抑制了5種草本觀賞植物幼苗的生長，但是化感抑制強度不同，說明不同受體植物幼苗的生長對化感物質(zhì)有著不同的敏感性，這與大多數(shù)的研究相一致[26,27].這可能是因為化感物質(zhì)具有專一性和選擇性，也可能與受體植物物種進(jìn)化有關(guān)，確切原因需要進(jìn)一步研究[28].另一方面，化感物質(zhì)對5種草本觀賞植物幼苗生長的化感效應(yīng)表現(xiàn)為“劑量效應(yīng)”，這可能和試驗選擇的作用濃度范圍有關(guān).

不同植物的不同發(fā)育時期對化感作用的敏感性不同[29].本研究結(jié)果表明，5種植物種子發(fā)芽階段受喜樹堿與10-羥基喜樹堿的影響較明顯，幼苗生長階段的影響主要表現(xiàn)為葉片相對電導(dǎo)率呈不同程度的上升、葉綠素含量下降、脯氨酸和可溶性蛋白先升后降.正常情況下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除是維持動態(tài)平衡的[30]，但本研究中化感物質(zhì)作用后打破了這一平衡，與CK0.5相比，5種植物內(nèi)部SOD、POD、CAT活性均先升后降，超出受體植物耐受范圍后，膜脂過氧化終產(chǎn)物MDA含量增加，植物代謝紊亂，與Zhao et al[31,32]的研究結(jié)果基本一致.表明喜樹堿類化感物質(zhì)可以影響植物的多種指標(biāo).本試驗中，化感作用后，植物種子萌發(fā)減少，幼苗細(xì)胞膜受到損害，Pro調(diào)節(jié)受到影響，植物的抗氧化酶活性發(fā)生變化，最終可使得植物在化感作用下生長緩慢甚至死亡，這可能是化感物質(zhì)在生長和生理生化指標(biāo)方面的作用機制之一，而對于植物光合熒光指標(biāo)的影響，還需后續(xù)試驗進(jìn)一步研究.因而，在園林綠化中，應(yīng)充分考慮植物間的化感作用，注重植物種類的選擇以及配置方式、栽植密度等因素，減少植物間的相互影響，從而實現(xiàn)園林景觀的生態(tài)美.

綜上所述，喜樹堿類物質(zhì)對白車軸草、大吳風(fēng)草、三色堇、麥冬和鳶尾5種受體植物表現(xiàn)出不同程度的化感抑制作用.但由于本試驗在室內(nèi)進(jìn)行，避免了自然條件下各種因素的干擾，雖然結(jié)果能較好地反映化感作用強弱，但在自然條件下，化感作用是極為復(fù)雜的，除了要受自然環(huán)境因子的影響外，植株間競爭效應(yīng)也會對化感作用的表現(xiàn)產(chǎn)生重要影響[33].因此，化感作用特點和自然條件對其他植物的影響是否和本研究所得結(jié)果一致，還需進(jìn)一步研究.