脂肪酶催化阿魏酸甘油酯的合成

王艷，薛也，高鵬，羅世雄，竇博鑫，辛嘉英,

1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點實驗室（哈爾濱 150076）；2. 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室（蘭州 730000）

阿魏酸是一種天然存在的植物酚酸，具有廣泛的生理活性，可防止中性粒細(xì)胞積聚，減小酪氨酸酶活性，降低黑色素生成，還具有抗氧化、清除自由基和預(yù)防癌癥的功能[1]。然而，阿魏酸的熔點高，其較弱的親水性和親脂性限制了其在各個方面的應(yīng)用[2-3]。阿魏酸和甘油的組合可顯著改善其水溶性，而不改變阿魏酸的紫外吸收、抗氧化性和其他功能性質(zhì)，通過分子改性獲得的阿魏酸衍生物具有抗氧化作用并且具有比阿魏酸更好的物理和化學(xué)性質(zhì)。在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[4-6]。

化學(xué)合成方法大多是基于多重保護(hù)和脫保護(hù)步驟[7]，由于許多副產(chǎn)物、環(huán)境污染嚴(yán)重、選擇性差、產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率低、反應(yīng)條件嚴(yán)格以及通常會破壞天然化合物的結(jié)構(gòu)等問題，不符合國際食品、添加劑的安全性和功能要求，并且在有機系統(tǒng)中，有機溶劑的引入會導(dǎo)致環(huán)境污染、反應(yīng)時間長、轉(zhuǎn)化率低、副產(chǎn)物的形成和副反應(yīng)的水解的問題影響酯化反應(yīng)的效率。脂肪酶是一種可以催化甘油酯的水解以產(chǎn)生甘油，并且能展現(xiàn)顯著的活性[8-10]。因此，試驗研究阿魏酸無溶劑體系的酯交換疏水改性，確立旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中脂肪酶催化阿魏酸和甘油反應(yīng)合成新型抗氧化劑阿魏酸甘油酯的方法，以達(dá)到提高阿魏酸的生理活性、擴大阿魏酸的應(yīng)用范圍、開發(fā)用于食品的新功能食品或食品添加劑中的目的[11]。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

阿魏酸（純度＞99%，蘇州暢通化學(xué)品有限公司）；DPPH（AR，天津市百世化工有限公司）；二甲基亞砜（AR，天津富宇化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Novozym 435脂肪酶（酶活10 000 U/g，丹麥諾維信公司）；氯仿（AR，北京化工廠）；丙酮（AR，天津富宇化學(xué)試劑有限公司）；苯（AR，天津渤海化工股份有限公司）；無水乙醇（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗儀器

精密分析天平（SBA224S，Sartorius公司）；電子天平（SBA2202S-CW，上海山岳科學(xué)儀器有限公司）；薄層色譜掃描儀（KH-2000，上海添時科學(xué)儀器有限公司）；可見分光光度計（722S，上海金梟科學(xué)儀器有限公司）；磁力攪拌器（EMS-8C，上海旌派儀器有限公司）；IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV 10，艾卡儀器設(shè)備有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9053，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 反應(yīng)體系的確定

精確稱取2份5.00 g阿魏酸于圓底燒瓶，加23.94 g甘油，1份溶于10 mL二甲基亞砜中，另1份無溶劑，分別取反應(yīng)物總質(zhì)量的10%固定化酶加入上述圓底燒瓶攪拌均勻，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，轉(zhuǎn)速采用70 r/min，在60 ℃下反應(yīng)10 h。反應(yīng)完畢后，用100 mL甲醇分兩次萃取，置于錐形瓶中封口，取0.5 μL樣品，采用薄層色譜檢測進(jìn)行定量分析。

1.3.2 反應(yīng)器的確定

以油浴或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV 10，IKA）為反應(yīng)器，圓底燒瓶或磨口三角瓶為反應(yīng)瓶，分別稱取一定量阿魏酸和甘油置于反應(yīng)瓶中，混勻后加入反底物總質(zhì)量的10%的酶開始反應(yīng)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的轉(zhuǎn)速150 r/min，于60 ℃反應(yīng)10 h。反應(yīng)完畢后，用100 mL甲醇分2次萃取，合并萃取液后置于錐形瓶中密封保存，取0.5 μL的萃取液，進(jìn)行薄層色譜分析

1.3.3 展開劑的選擇

將硅膠板放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱活化1 h，取出后靜置至室溫，稱取0.1 g阿魏酸于試管中，用10 mL甲醇溶解，用量筒量取40 mL不同種類的展開劑（1，2，3，4和5）倒入展開缸中，用微量進(jìn)樣器取0.5 μL阿魏酸樣液，滴在硅膠板上作為對照點，用甲醇潤洗微量進(jìn)樣器1～2次，另取0.5 μL阿魏酸甘油酯樣液，滴在硅膠板上與對照點等高間距2～3 cm處。將硅膠板放入展開缸中，30 min后取出靜置，在紫外光照射下觀察。展開劑種類及比例見表1。

表1 展開劑的種類及比例

1.3.4 單因素試驗

稱取5.00 g阿魏酸置于圓底燒瓶，加23.94 g甘油，取定量固定化酶加入上述圓底燒瓶攪拌均勻，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，轉(zhuǎn)速50～90 r/min，反應(yīng)一段時間。反應(yīng)完畢后，用100 mL甲醇分兩次萃取，置于錐形瓶中封口，取0.5 μL樣品，采用薄層色譜檢測進(jìn)行定量分析。采用單因素試驗（因素水平設(shè)計見表2），考察溫度、時間、酶用量、轉(zhuǎn)速對阿魏酸轉(zhuǎn)化率的影響以輔助確定較好的試驗點。

表2 單因素試驗因素水平表

1.3.5 正交試驗

采用正交試驗考察各因素對阿魏酸轉(zhuǎn)化率的影響。因素水平設(shè)計見表3。

表3 正交試驗因素水平表

選擇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，反應(yīng)器轉(zhuǎn)速設(shè)定為70 r/min，采用無溶劑體系，按L9(34)正交表進(jìn)行試驗，如表4所示。

表4 L9(34)正交表

1.3.6 薄層色譜檢測

采用薄層色譜技術(shù)對樣品液進(jìn)行檢測，先將硅膠板放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱活化1 h，取出后靜置至室溫，準(zhǔn)確稱取0.1 g阿魏酸放入試管中，加入10 mL甲醇溶解，將其作為對照組，按最優(yōu)展開劑及其比例量取40 mL展開劑于展開缸中，用微量進(jìn)樣器取0.5 μL阿魏酸樣液，滴在硅膠板上作為對照點，用甲醇潤洗微量進(jìn)樣器1～2次，取0.5 μL阿魏酸甘油酯樣液，滴在硅膠板上與對照點等高間距2～3 cm處。將硅膠板放入展開缸中，30 min后取出靜置，在薄層色譜掃描儀下測定得到阿魏酸標(biāo)樣與產(chǎn)物峰面積比S1/S2，根據(jù)式（1）和（2）計算出轉(zhuǎn)化率（α）。

式中：S1/S2為阿魏酸標(biāo)樣與產(chǎn)物峰面積比；C1為阿魏酸樣液濃度；Cx為阿魏酸甘油酯樣液濃度；V為樣液滴加量；M為阿魏酸甘油酯的相對分子質(zhì)量；m標(biāo)為反應(yīng)中阿魏酸的添加量。

1.3.7 清除DPPH自由基能力檢測

一組取分別為0，0.312 5，0.625 0，1.250 0，2.500 0和5.000 0 mL的阿魏酸樣液，另一組去同等體積的阿魏酸甘油酯產(chǎn)物，全部定容至10 mL及配制濃度6×10-5mol/L的DPPH溶液。取12個10 mL試管，向試管中加3.5 mL DPPH溶液，分別向試管中加0.5 mL不同濃度的樣液，搖勻，放置于暗處反應(yīng)30 min。以乙醇溶液作為空白，使用可見分光光度計在517 nm處分別測定樣品液與DPPH溶液混合后溶液的吸光度Ai，樣品液與乙醇混合后溶液的吸光度Aj，DPPH溶液與乙醇混合后的溶液吸光度A0。并根據(jù)式（3）計算抑制率[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)體系及反應(yīng)器選擇的結(jié)果分析

在合成阿魏酸甘油酯的研究中，考慮通過反應(yīng)體系的構(gòu)建和反應(yīng)器的選擇實現(xiàn)副產(chǎn)物乙醇的及時去除，并篩選出對脂肪酶活性抑制較小且底物混溶程度較好的有機溶劑。無論是有機溶劑體系還是無溶劑體系，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中的酶催化活性較好，這主要由于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀可以去除副產(chǎn)物乙醇，避免其對酶活性的抑制作用和促進(jìn)反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行。由于阿魏酸和甘油在有機溶劑中的溶解度較差，因此，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中無溶劑體系下固定化脂肪酶Novozyme 435催化阿魏酸的轉(zhuǎn)化率最高，為85.30%，如表5所示。

表5 反應(yīng)體系及反應(yīng)器構(gòu)建結(jié)果

2.2 展開劑及其比例的選擇

薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法，利用阿魏酸及阿魏酸甘油酯的極性大小不同[13]，極性大小不同使得兩種物質(zhì)分離，通過觀察在紫外光照射下兩種物質(zhì)的距離確定展開劑的效果，在薄層色譜掃描儀下測定得到峰面積比，進(jìn)而計算阿魏酸轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表6及圖1。

由表6和圖1可知，為得到準(zhǔn)確的試驗數(shù)據(jù)，薄層色譜檢測中展開劑應(yīng)選用三氯甲烷-苯-甲醇-乙酸，展開劑比例為32∶20∶1.5∶1。

2.3 基本反應(yīng)條件對轉(zhuǎn)化率的影響

在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中無溶劑體系下利用固定化脂肪酶催化阿魏酸和甘油合成阿魏酸甘油酯的反應(yīng)過程中，反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)器轉(zhuǎn)速及酶用量均會對反應(yīng)造成一定影響。由圖2和表7可知，反應(yīng)時間和反應(yīng)器轉(zhuǎn)速對其影響最為顯著，其次是反應(yīng)溫度和酶用量。轉(zhuǎn)速150 r/min時基本可以排除傳質(zhì)的限制和有效去除副產(chǎn)物乙醇對反應(yīng)的影響。最佳反應(yīng)時間為10 h，這說明反應(yīng)進(jìn)行到10 h后基本達(dá)到平衡，因此再延長時間轉(zhuǎn)化率也不會有明顯升高。適宜的反應(yīng)溫度對酶催化活性的發(fā)揮和傳質(zhì)有利，從結(jié)果可知最佳反應(yīng)溫度為60 ℃，此時其轉(zhuǎn)化率最高。酶促反應(yīng)過程中，酶用量是影響經(jīng)濟效益的主要因素，從試驗結(jié)果可以看出，酶用量超過10%時，轉(zhuǎn)化率基本維持不變，說明此時酶活性中心已經(jīng)飽和，過多的酶只能在一定范圍內(nèi)縮短達(dá)到反應(yīng)平衡的時間，并不能改變其轉(zhuǎn)化率，因此最佳酶用量為10%。由表7可知，最佳的工藝條件為：溫度60 ℃，酶用量10%，反應(yīng)時間10 h，轉(zhuǎn)速150 r/min。在此條件下阿魏酸的轉(zhuǎn)化率最高，為85.30%。2.4 清除DPPH自由基能力的結(jié)果與分析

DPPH是一種比較穩(wěn)定的自由基，而且它的使用最為廣泛，常用來評價物質(zhì)的抗氧化能力[14-15]。試驗中，采用不同濃度阿魏酸樣液及阿魏酸甘油酯來測定對DPPH自由基清除能力，根據(jù)抑制率來判斷其抗氧化能力。由表9和表10可知，阿魏酸抑制率最大為84.70%，阿魏酸甘油酯抑制率最大為85.60%，阿魏酸甘油酯清除能力強于阿魏酸。從分子結(jié)構(gòu)的角度考慮，推測阿魏酸甘油酯可能是因為含有酚羥基，具有很強的給氧能力，從而增大清除自由基能力。

表6 不同展開劑的結(jié)果

圖1 不同展開劑的結(jié)果

圖2 基本反應(yīng)條件對Novozyme 435催化阿魏酸甘油酯合成的影響

表7 正交試驗結(jié)果

表8 方差分析表

表9 不同濃度阿魏酸的抑制率

表10 不同濃度阿魏酸甘油酯的抑制率

3 結(jié)論

試驗采用在無溶劑體系下通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀使用脂肪酶催化阿魏酸與甘油合成阿魏酸甘油酯的方法，并優(yōu)化催化過程中條件。合成后阿魏酸甘油酯對DPPH自由基有一定清除作用，且清除能力強于阿魏酸。從分子結(jié)構(gòu)角度考慮，推測阿魏酸甘油酯可能是因為含有酚羥基，具有很強的給氧能力，使其呈現(xiàn)強抗氧化性和清除自由基能力，有望將該方法合成的阿魏酸甘油酯更好運用于食品、食品添加劑中。