競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法檢測(cè)人抗脊髓灰質(zhì)炎病毒（Ⅲ型）中和抗體

張冰潔，趙衛(wèi)忠，高菁霞，朱文勇，李衛(wèi)東，廖國(guó)陽(yáng)

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明 650018）

脊髓灰質(zhì)炎（俗稱小兒麻痹，簡(jiǎn)稱脊灰）是由脊髓灰質(zhì)炎病毒（分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)型）引起的一種嚴(yán)重危害人類（特別是嬰幼兒）健康的急性傳染病，主要通過(guò)消化道感染后再形成二次病毒血癥，常累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成永久性殘疾或死亡[1-2]。上世紀(jì)50 年代以來(lái)，疫苗的廣泛使用為在全世界范圍內(nèi)消除脊灰提供了有效手段[3-5]。全球范圍內(nèi)的最后一例Ⅲ型野生脊灰病毒是在2012年在尼日利亞北部檢出。世界衛(wèi)生組織（WHO）在2015 年正式宣布Ⅲ型脊灰病毒被消滅。為了維持無(wú)Ⅲ型脊灰狀態(tài)，免疫效果的監(jiān)測(cè)成為了問(wèn)題。根據(jù)全球根除脊灰行動(dòng)計(jì)劃（GAP3）的進(jìn)程，活病毒包括減毒株在內(nèi)的所有脊灰活病毒都將要被封存，只能在WHO 認(rèn)可的少數(shù)實(shí)驗(yàn)室中使用，這給脊灰中和抗體評(píng)價(jià)免疫力帶來(lái)了的難題[6]。所以迫切需要一種快速、準(zhǔn)確并且易于在基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)實(shí)施的檢測(cè)方法，用于疫苗免疫后效果監(jiān)測(cè)和人群免疫屏障的監(jiān)測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室早在2007 年建立了多克隆抗體雙抗體夾心ELISA 方法用于檢測(cè)血清中和抗體水平[7]，但仍然有進(jìn)一步研究的價(jià)值。本研究建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法，并從特異性，靈敏性，穩(wěn)定性和重復(fù)性方面進(jìn)行詳細(xì)研究。使用來(lái)源于臨床的80 份血清作為研究對(duì)象，與中和試驗(yàn)進(jìn)行一致性研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人喉表皮樣癌細(xì)胞（HEP-2）購(gòu)自于美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)（ATCC）（CCL-23TM），保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，在本研究中HEP-2 細(xì)胞工作代次為：第189 代。

1.2 抗原與抗體

脊髓灰質(zhì)炎Ⅲ型的Sabin 株病毒滅活液由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物四室生產(chǎn)并純化后獲得，批號(hào)為2016052310，經(jīng)質(zhì)量鑒定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，該批次Sabin Ⅲ型的D 抗原含量為3 187 DU/mL；兔多克隆抗脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體由生物制品五室制備并保存，經(jīng)純化后檢測(cè)其總蛋白濃度為3 mg/mL；待測(cè)人血清標(biāo)本來(lái)源于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，由該科室負(fù)責(zé)血清的分離和血清的人口學(xué)調(diào)查。

羊多克隆抗兔抗體，有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記（HRP-Goat-anti-Rabbit IgG）購(gòu)自Abcam 公司，Cat.No.ab6721；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自VETEC 公司；TMB 單組份顯色液購(gòu)自Solarbio 公司，Cat.No.PR1200。

1.3 溶液配制

MEM（50 L 裝）粉劑和M199（50 L 裝）粉劑均購(gòu)自Gibco 公司，（Lot No.1778268）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所溶液組配置，滅菌和分裝；新生牛血清購(gòu)自蘭洲民海生物工程有限公司（Lot No.20180925）。

競(jìng)爭(zhēng)ELISA 稀釋液：KH2PO40.2 g，Na2HPO4·12 H2O 2.87 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，加蒸餾水1 000 mL，高壓滅菌室溫保存；再加入BSA 5 g，Tween-20 0.5 mL，充分混勻后備用。競(jìng)爭(zhēng)ELISA洗液：在上述稀釋液基礎(chǔ)上，不加5 g 的BSA 即為洗板液。

競(jìng)爭(zhēng)ELISA 反應(yīng)終止液使用2 mol/L H2SO4，即將濃硫酸11.1 mL 緩慢加入到88.9 mL 去離子水中，充分混勻后備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 競(jìng)爭(zhēng)ELISA 實(shí)驗(yàn)條件探索 采用方陣法[8-9]，首先對(duì)最佳包被抗原的使用量和兔多抗脊灰抗體的最佳稀釋度進(jìn)行探索。該抗原和抗體的稀釋梯度設(shè)置見(jiàn)表1。

用稀釋液將Sabin Ⅲ型D 抗原濃縮液按要求進(jìn)行倍比稀釋后加入酶標(biāo)板，每孔加100 μL，4 ℃過(guò)夜；洗板2 次后加入不同稀釋度的兔抗脊灰抗體100 μL/孔，37℃孵育1.5 h；洗板3 次后加入羊抗兔HRP-IgG （1:6 000），100 μL/ 孔，37℃孵育1 h；洗板4 次加入底物TMB 顯色，100 μL/孔，室溫避光孵育10 min；加入50 μL 終止液，最后測(cè)定OD450nm值。

篩選指標(biāo)：OD450nm值在0.9～1.8 并且與左右相差較大的反應(yīng)孔抗原濃度與兔抗脊灰抗體稀釋度即為最佳抗原包被量與抗體最佳稀釋度[8-10]。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 待測(cè)血清最佳稀釋倍數(shù)：將待測(cè)血清以2 為梯度進(jìn)行倍比稀釋，從1:4 到1:512 之間，然后與兔多抗脊灰共同孵育，通過(guò)抑制率優(yōu)化待測(cè)血清的稀釋倍數(shù)。

陽(yáng)性閾值的確定：使用16 份經(jīng)過(guò)中和試驗(yàn)確定為陰性的血清，使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法檢測(cè)，計(jì)算每一份血清的抑制率，然后計(jì)算平均抑制率和標(biāo)準(zhǔn)差，陽(yáng)性血清的閾值為平均抑制率加上三倍的標(biāo)準(zhǔn)差。

最高檢出稀釋倍數(shù)的確定：將經(jīng)過(guò)中和試驗(yàn)確定為陽(yáng)性的血清，隨機(jī)抽取24 份，然后進(jìn)行2 為梯度，更多倍比稀釋，從1:8 到1:1024 之間。當(dāng)抑制率接近閾值但大于閾值的稀釋倍數(shù)即為待測(cè)血清的最高稀釋倍數(shù)，也稱為靈敏度。

重復(fù)性特征：分別進(jìn)行了同一塊酶標(biāo)板中4 復(fù)孔的批內(nèi)差異性分析，不同4 塊酶標(biāo)板的批間差異性分析，以及兩名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的工作人員進(jìn)行的人員差異性分析，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，批內(nèi)、批間和人員變異系數(shù)應(yīng)＜10%，表示重復(fù)性較好[7]。

1.4.3 微量中和試驗(yàn) 使用抗體稀釋法測(cè)定待測(cè)血清中的中和抗體滴度，首先待測(cè)血清從1:4 到1:1024，進(jìn)行2 為梯度的倍比稀釋，取50 μL，然后與滴度為106.625TCID50/mL 的病毒50 μL 在37℃條件下孵育2 h，然后加入Hep-2 細(xì)胞，細(xì)胞密度為106個(gè)/mL，于35℃培養(yǎng)7 d，通過(guò)CPE 的觀察，計(jì)算待測(cè)抗體的最終中和抗體效價(jià)[11-12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件和Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，顯著性檢驗(yàn)為Pair Sample T Test 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)方法反應(yīng)條件的優(yōu)化

將不同濃度的包被抗原（D 抗原）與不同稀釋度的兔抗脊灰（多抗）采用方陣滴定法確定了最佳工作濃度條件，結(jié)果見(jiàn)表1。然后在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化得到競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)條件為：包被抗原使用濃度：99.6 DU/mL；兔抗脊灰稀釋倍數(shù)為1:4000。酶標(biāo)抗體HRP 標(biāo)記，羊抗兔（多抗）選擇直線相關(guān)性有著良好的范圍內(nèi)的最佳工作濃度為：0.33 μg/mL。

表1 方陣滴定法確定包被抗原和兔抗脊灰的稀釋倍數(shù)的OD450nm 檢測(cè)值Tab.1 Square titration method to determine the OD450nm detection value of the dilution multiples of coating antigen and rabbit anti-polio

2.2 待測(cè)血清最適稀釋倍數(shù)和臨界值的確定

將16 份經(jīng)過(guò)中和試驗(yàn)證實(shí)的陰性血清，按照不同梯度進(jìn)行稀釋，檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)ELISA 的OD450nm值，結(jié)果見(jiàn)圖1，觀察發(fā)現(xiàn)待測(cè)血清在1:16 稀釋條件下，OD 值進(jìn)入平臺(tái)，曲線斜率降低，該條件為待測(cè)血清的最適稀釋倍數(shù)。同時(shí)計(jì)算其平均抑制率為25.03%，SD 為0.013，根據(jù)公式計(jì)算陽(yáng)性血清的抑制率臨界值為28.93%，待測(cè)血清在1:16 稀釋條件下，抑制率大于該值方能判斷為陽(yáng)性。

圖1 16 份陰性血清在競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法中抑制率的散點(diǎn)圖Fig.1 The distribution of scatter plot of inhibition rate of 16 negative serum in competitive ELISA

2.3 競(jìng)爭(zhēng)ELISA 與中和試驗(yàn)結(jié)果的一致性

對(duì)64 份待測(cè)血清，同時(shí)使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法和中和試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，通過(guò)χ2檢驗(yàn)，表面兩種檢測(cè)方法在陽(yáng)性檢出中，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 血清Ⅲ型抗體競(jìng)爭(zhēng)體ELISA 法與中和試驗(yàn)檢測(cè)方法的比較Tab.2 The results of competition ELISA method and neutralization testing about type serum Ⅲantibody

2.4 競(jìng)爭(zhēng)ELISA 的特異性

檢測(cè)D 抗原和C 抗原上的特異性，將相同濃度99.6 DU/mL 的D 抗原，和56℃，1 h 高溫條件下得到的C 抗原同時(shí)按照上述操作進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)D 抗原轉(zhuǎn)換為C 抗原后，在使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA，兔抗脊灰不能與之結(jié)合，人抗脊灰也不能形成相應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)。所以本研究建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA 具有脊灰病毒D 抗原特異性。

在型上的特異性：使用D 抗原作為包被抗原，在三個(gè)型別特異性上進(jìn)行驗(yàn)證，分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗原，按照相同的D 抗原濃度進(jìn)行包被，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅲ型抗體與其它兩個(gè)型的抗原不發(fā)生交叉反應(yīng)。所以本研究建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA 具有脊灰病毒Ⅲ型特異性。

2.5 靈敏特性

將待測(cè)血清按照1:2 的梯度進(jìn)行倍比稀釋，然后使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果觀察到，當(dāng)待測(cè)血清稀釋度為1:256 時(shí)，抑制率能保持31.22%，但是進(jìn)一步待測(cè)血清稀釋度為1:512 時(shí)，抑制率為26.73%。所以競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)檢測(cè)的待測(cè)血清的最高稀釋倍數(shù)為256 倍，最適稀釋倍數(shù)為16 倍。

2.6 重復(fù)性驗(yàn)證

在相同的酶標(biāo)板中，平行選擇四孔復(fù)孔進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)檢測(cè)，其變異系數(shù)在3.296 %～4.518%；選擇六塊酶標(biāo)板進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，其變異系數(shù)在5.26%～6.11%；對(duì)兩名專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行培訓(xùn)后使用相同檢測(cè)試劑進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，其變異系數(shù)為7.21%～8.245%。結(jié)果表明該檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

3 討論

目前全球正處于消滅脊灰的最后階段，Ⅱ和Ⅲ型脊灰病毒已宣布被消滅，目前僅脊灰病毒Ⅰ型野毒株在阿富汗，尼日利亞和巴基斯坦等國(guó)家和地區(qū)流行，但由于疫苗衍生毒株的產(chǎn)生，以及生活環(huán)境污水中脊灰能存活3～5 a 等因素下，在全球范圍內(nèi)消除脊灰仍然任重而道遠(yuǎn)[13-15]。解決的有效手段是加強(qiáng)人群的免疫，特別是新生嬰幼兒，及時(shí)建立并鞏固人群免疫屏障，并完善相應(yīng)的疫苗免疫效果監(jiān)測(cè)與管理[14-15]。另一個(gè)方面，封存脊灰野毒株以及Sabin 株的大前提下，建立開(kāi)發(fā)新的可靠的檢測(cè)方法成為了一項(xiàng)重要工作，因?yàn)橐坏┓獯?，過(guò)去建立在中和試驗(yàn)基礎(chǔ)上的免疫效果監(jiān)測(cè)就將難以開(kāi)展，所以本研究具有很好的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究成功建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法檢測(cè)人抗脊灰中和抗體的方法，不使用活的脊灰病毒，符合國(guó)家規(guī)程的要求。而且與2007 年的雙抗體夾心ELISA 方法[7]檢測(cè)的不同，在一定程度上于提高了樣品檢測(cè)的陽(yáng)性率，避免了假陰性的檢驗(yàn)誤差，能夠更加真實(shí)地反映人群中的抗體水平。競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法通過(guò)抑制率作為陽(yáng)性判斷的標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的科學(xué)性，能夠有效判斷待測(cè)血清的結(jié)果，而不簡(jiǎn)單依賴于OD 值的判斷，有效減少了誤差。

WHO 在上世紀(jì)就提出了消滅脊灰行動(dòng)，我國(guó)目前也保持無(wú)脊灰狀態(tài)多年，但是由于脊灰疫苗相關(guān)病例與VDPV 循環(huán)，以及全球交通互通互聯(lián)加快，人口流動(dòng)的范圍、速度、頻次增加，病毒輸入和傳播的機(jī)率加大，所以對(duì)脊灰抗體水平的監(jiān)測(cè)是一項(xiàng)長(zhǎng)期的工作[16-17]，本研究為該工作的開(kāi)展提供了一種行之有效的方法，值得在廣大基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)中推廣。