褐藻糖膠對(duì)小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊作用及機(jī)制

程雨菲 朱曉巖 馬愛(ài)軍 潘旭東

[摘要] 目的 探討褐藻糖膠對(duì)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型的作用及Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥通路蛋白表達(dá)的影響。方法 雄性ApoE-/-小鼠36只，隨機(jī)分為對(duì)照組（普通飲食）、模型組（頸動(dòng)脈套管+高脂飲食+生理鹽水）和褐藻糖膠組（頸動(dòng)脈套管+高脂飲食+褐藻糖膠），每組12只。8周后檢測(cè)各組小鼠血脂水平，采用蘇木精-伊紅（HE）染色方法觀察小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈病理改變，ELISA法測(cè)定炎性因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達(dá)水平，Western Blot方法檢測(cè)頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）、IL-1β蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與模型組比較，褐藻糖膠組小鼠血脂水平明顯降低，頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊明顯減少，IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)降低，差異均有顯著性（F=8.31～190.73，P<0.05）。模型組頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著升高，而褐藻糖膠組各蛋白表達(dá)較模型組下降（F=50.22～120.59，P<0.05）。結(jié)論 褐藻糖膠能夠通過(guò)下調(diào)NLRP3炎性小體通路抑制炎癥而發(fā)揮抗頸動(dòng)脈粥樣硬化作用。

[關(guān)鍵詞] 褐藻糖膠;斑塊，動(dòng)脈粥樣硬化;NLR家族，熱蛋白結(jié)構(gòu)域包含蛋白3

[中圖分類(lèi)號(hào)] R543.5 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號(hào)] 2096-5532（2020）05-0536-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.131 [開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of fucoidan on carotid atherosclerotic vulnerable plaques and expression of Nod-like receptor family， pyrin domain-containing protein 3 （NLRP3）-related inflammatory pathway proteins in ApoE-/- mice fed with high-fat diet. ?Methods A total of 36 male ApoE-/- mice were randomly divided into control group （normal diet）， model group （carotid collar+high-fat diet+normal saline）， and fucoidan group （carotid collar+high-fat diet+fucoidan）， with 12 mice in each group. After 8 weeks， blood lipid levels were measured; hematoxylin-eosin staining was used to observe the pathological changes of the right common carotid artery; ELISA was used to measure the levels of the inflammatory factors interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α）; Western Blot was used to measure the protein expression of NLRP3， Caspase-1， and IL-1β in atherosclerotic plaques. Results Compared with the model group， the fucoidan group had significant reductions in blood lipid levels， carotid atherosclerotic vulnerable plaques， and expression of IL-1β， IL-6， and TNF-α （F=8.31-190.73，P<0.05）. Compared with the control group， the model group had significant increases in the protein expression of NLRP3， Caspase-1， and IL-1β in carotid atherosclerotic plaques， and compared with the model group， the fucoidan group had significant reductions in the expression of these proteins （F=50.22-120.59，P<0.05）. ?Conclusion Fucoidan can effectively atte-nuate carotid atherosclerosis by downregulating the NLRP3 inflammasome pathway.

[KEY WORDS] fucoidan; plaque， atherosclerotic; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein

缺血性腦卒中是威脅人類(lèi)生命的主要疾病之一[1]，其主要危險(xiǎn)因素是頸動(dòng)脈粥樣硬化[2]。有研究表明，頸動(dòng)脈粥樣硬化是一種緩慢發(fā)展的免疫炎癥反應(yīng)過(guò)程[3]，從粥樣硬化斑塊形成、發(fā)展至斑塊破裂，多種炎癥細(xì)胞和炎癥因子參與其中[4]。因此，探討抑制炎癥反應(yīng)的干預(yù)措施以控制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展，對(duì)治療缺血性腦卒中具有重要意義。褐藻糖膠是海洋類(lèi)褐藻植物中一種特有的多糖，有研究表明褐藻糖膠能夠調(diào)節(jié)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放，抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）活化而反應(yīng)性抑制促炎基因表達(dá)[5]，但其對(duì)頸動(dòng)脈易損斑塊的作用及具體機(jī)制尚未有研究。Nod樣受體蛋白3（NLRP3）在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[6-8]，NLRP3基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）分泌明顯降低[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型，觀察褐藻糖膠對(duì)頸動(dòng)脈斑塊NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)影響，探討褐藻糖膠對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

褐藻糖膠（Sigma-Aldrich公司），用0.22 mm孔徑過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，并在-20 ℃條件下保存為褐藻糖膠提取物（10 g/L），直至使用。6周齡大小C57BL/6背景ApoE-/-基因敲除雄性小鼠（北京Vital River公司）36只，體質(zhì)量為18～22 g，標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由進(jìn)食、飲水，每籠3只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后用于實(shí)驗(yàn)。NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）、IL-1β（CST公司），ELISA檢測(cè)試劑盒（eBioscience公司），ECL顯影液（Millipore公司）。

1.2 動(dòng)物分組及處理

將36只小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、褐藻糖膠組（實(shí)驗(yàn)組），每組12只。模型組、褐藻糖膠組小鼠于右側(cè)頸總動(dòng)脈插入頸動(dòng)脈套管，并給予高脂飼料（每100.00 g飼料含膽固醇0.25 g、脂肪15.00 g）喂養(yǎng)制備小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型[10]。對(duì)照組不手術(shù)，給予普通飼料喂養(yǎng)。模型制備后第4周褐藻糖膠組小鼠給予褐藻糖膠30 mg/（kg·d）腹腔注射，對(duì)照組及模型組腹腔注射等量生理鹽水，共注射4周。所有動(dòng)物研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵循美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院修訂的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》[11]。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 標(biāo)本采集 小鼠禁食12 h（正常飲水），腹腔注射100 g/L水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，內(nèi)眥動(dòng)脈取血;處死小鼠后固定于鼠板，沿頸部正中線剪開(kāi)皮膚，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，然后剪下套管兩端長(zhǎng)度約0.5 cm血管。

1.3.2 血脂測(cè)定 取小鼠內(nèi)眥動(dòng)脈血約3 mL，3 000 r/min離心取上清，測(cè)定總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）水平。

1.3.3 病理觀察 將離體的右側(cè)頸總動(dòng)脈用40 g/L多聚甲醛固定，乙醇脫水、浸蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察血管動(dòng)脈粥樣硬化形成情況。1.3.4 血清IL-1β、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平檢測(cè) 采用ELISA方法分別檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.5 頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β水平測(cè)定 應(yīng)用Western Blot方法。用RIPA裂解液裂解頸動(dòng)脈組織，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。室溫封閉后2 h后與一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST洗滌后，加二抗在室溫下孵育1 h，ECL顯影。應(yīng)用圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，以目的條帶與GAPDH的灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組內(nèi)兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 各組小鼠血清脂質(zhì)水平比較

模型組血清TC、TG、LDL水平與對(duì)照組比較明顯升高，而褐藻糖膠組血清TC、TG、LDL水平較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.31～126.25，P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊形成比較

光鏡下可見(jiàn)，對(duì)照組小鼠血管未見(jiàn)明顯粥樣斑塊，管壁3層結(jié)構(gòu)明顯，內(nèi)膜完整;模型組小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)見(jiàn)明顯粥樣硬化斑塊形成，斑塊內(nèi)見(jiàn)泡沫細(xì)胞浸潤(rùn)，部分破裂，血栓形成;而褐藻糖膠組小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)粥樣斑塊明顯減輕，泡沫細(xì)胞減少。見(jiàn)圖1。

2.3 各組小鼠血清炎癥因子水平比較

模型組小鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)較對(duì)照組升高，褐藻糖膠組各血清炎癥因子水平較模型組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=60.21～190.73，P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 各組NLRP3炎性小體通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達(dá)明顯增高;與模型組比較，褐藻糖膠組NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(dá)降低，差異有顯著性（F=50.22～120.59，P<0.05）。見(jiàn)圖2、表3。

3 討 ?論

炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展以及血栓形成中起著重要的作用[3]。褐藻糖膠是以L-褐藻糖為基礎(chǔ)的多糖，具有多種生物學(xué)功能，包括抗炎、抗血管生成、抗凝血、抗腫瘤等，是天然海洋藥物研究的熱點(diǎn)[12-14]。然而，褐藻糖膠在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及其機(jī)制尚不清楚。本文利用頸動(dòng)脈套管合并高脂飼料飼養(yǎng)構(gòu)建ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型，探討褐藻糖膠對(duì)ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化的作用及其機(jī)制。

有研究結(jié)果顯示，褐藻糖膠可以調(diào)節(jié)高脂喂養(yǎng)ApoEshl小鼠血脂水平及動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[15]。本文結(jié)果與其一致。本文結(jié)果顯示，褐藻糖膠干預(yù)后小鼠血清TC、TG和LDL水平較模型組明顯降低;病理觀察顯示，與對(duì)照組相比，模型組頸動(dòng)脈血管內(nèi)壁有大量脂質(zhì)及泡沫細(xì)胞堆積，血管腔嚴(yán)重堵塞，而褐藻糖膠組頸動(dòng)脈血管內(nèi)壁斑塊面積及脂滴明顯減少，提示褐藻糖膠能夠緩解小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的發(fā)生和進(jìn)展。TNF-α介導(dǎo)全身炎癥和免疫反應(yīng)，在慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮作用[16-17]。IL-6及IL-1β都是促炎性細(xì)胞因子，可刺激炎癥的產(chǎn)生，促進(jìn)免疫性疾病的發(fā)生，在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中起到重要作用[18-20]。有研究顯示，褐藻糖膠能夠調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子[21]。本文ELISA檢測(cè)顯示，褐藻糖膠能夠明顯降低ApoE-/-小鼠炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌。表明褐藻糖膠能夠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

研究表明，褐藻糖膠能夠影響炎癥因子IL-1β表達(dá)，而在眾多調(diào)節(jié)炎性因子IL-1β成熟和分泌的通路中，NLRP3炎性小體依賴性的經(jīng)典通路尤為重要[7，20]。NLRP3炎癥小體是NLRs家族中的一員，是由感受蛋白NLRP3、銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC和效應(yīng)蛋白激酶Caspase-1等組成的復(fù)合物[22-23]。已有研究顯示，膽固醇結(jié)晶、氧化低密度脂蛋白、血流動(dòng)力異常都會(huì)激活單核巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體，進(jìn)而誘導(dǎo)Caspase-1介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子IL-1β的成熟分泌，導(dǎo)致心腦血管疾病和事件的發(fā)生[24]。因此，抑制NLRP3炎性小體能夠控制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，降低因不穩(wěn)定斑塊造成的缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)。本文采用Western Blot方法檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織NLRP3炎性小體及IL-1β水平，結(jié)果顯示，與模型組相比較，褐藻糖膠組NLRP3蛋白的表達(dá)降低，Caspase-1蛋白及下游炎性細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)減少，一定程度上表明褐藻糖膠能夠通過(guò)下調(diào)NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，褐藻糖膠能夠通過(guò)下調(diào)NLRP3炎性小體通路抑制炎癥而發(fā)揮抗頸動(dòng)脈粥樣硬化作用。本文結(jié)果可為抗動(dòng)脈粥樣硬化輔助治療提供候選藥物。

[參考文獻(xiàn)]

[1] LOPEZ A. Measuring the global burden of disease[J]. The New England Journal of Medicine， 2013，369（5）：448-457.

[2] GBD 2016 Stroke Collaborators. Global， regional， and national burden of neurological disorders，1990—2016： a systematic ana-lysis for the Global Burden of Disease Study 2016[J]. The Lancet Neurology， 2019，18（5）：459-480.

[3] HANSSON G K， HERMANSSON A. The immune system in atherosclerosis[J]. Nat Immunol， 2011，12（3）：204-212.

[4] TOUSOULIS D， OIKONOMOU E， ECONOMOU E K， et al. Inflammatory cytokines in atherosclerosis：current therapeutic approaches[J]. Eur Heart J， 2016，37（22）：1723-1732.

[5] ASANKA SANJEEWA K K， JAYAWARDENA T U， KIM H S， et al. Fucoidan isolated from Padina commersonii inhibit LPS-induced inflammation in macrophages blocking TLR/NF-κB signal pathway[J]. Carbohydr Polym， 2019，224：115195.

[6] DUEWELL P， KONO H， RAYNER K J， et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals[J]. Nature， 2010，464（7293）：1357-1361.

[7] HOSEINI Z， SEPAHVAND F， RASHIDI B， et al. NLRP3 inflammasome： Its regulation and involvement in atherosclerosis[J]. J Cell Physiol， 2018，233（3）：2116-2132.

[8] MANGAN M S J， OLHAVA E J， ROUSH W R， et al. Targeting the NLRP3 inflammasome in inflammatory diseases[J]. Nat Rev Drug Discov， 2018，17（9）：688-695.

[9] ZHENG F， XING S S， GONG Z S， et al. Silence of NLRP3 suppresses atherosclerosis and stabilizes plaques in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Mediat Inflamm， 2014（4）：507-518.

[10] SUDIRMAN S， ONG A D， CHANG H W， et al. Effect of fucoidan on anterior cruciate ligament transection and medial meniscectomy induced osteoarthritis in high-fat diet-induced obese rats[J]. Nutrients， 2018，10（6）：686.

[11] LIBBY P， LICHTMAN A H， HANSSON G K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis：from mice to humans[J]. Immunity， 2013，38（6）：1092-1104.

[12] YANG X， WANG S， TRANGLE S S， et al. Investigation of different molecular weight fucoidan fractions derived from new zealand Undaria pinnatifida in combination with GroA therapy in prostate cancer cell lines[J]. Marine Drugs， 2018，16（11）：454.

[13] LI X J， YE Q F. Fucoidan reduces inflammatory response in a rat model of hepatic ischemia-reperfusion injury[J]. Can J Physiol Pharmacol， 2015，93（11）：999-1005.

[14] PARK J， CHA J D， CHOI K M， et al. Fucoidan inhibits LPS-induced inflammation in vitro and during the acute response in vivo[J]. International Immunopharmacology， 2017，43：91-98.

[15] YOKOTA T， NOMURA K， NAGASHIMA M， et al. Fucoidan alleviates high-fat diet-induced dyslipidemia and atherosclerosis in ApoE（shl） mice deficient in apolipoprotein E expression[J]. J Nutr Biochem， 2016，32（3）：46-54.

[16] TAY C， LIU Y H， HOSSEINI H， et al. B-cell-specific depletion of tumour necrosis factor alpha inhibits atherosclerosis development and plaque vulnerability to rupture by reducing cell death and inflammation[J]. Cardiovascular Research， 2016，111（4）：385-397.

[17] OBEROI R， VLACIL A K， SCHUETT J， et al. Anti-tumor necrosis factor-α therapy increases plaque burden in a mouse model of experimental atherosclerosis[J]. Atherosclerosis， 2018，27（7）：80-89.

[18] LARSSON P T， HALLERSTAM S， ROSFORS S， et al. Circulating markers of inflammation are related to carotid artery atherosclerosis[J]. Int Angiol： a J Int Union Angiol， 2005，24（1）：43-51.

[19] SONG L， SCHINDLER C. IL-6 and the acute phase response in murine atherosclerosis[J]. Atherosclerosis， 2004，177（1）：43-51.

[20] GREBE A， HOSS F， LATZ E. NLRP3 inflammasome and the IL-1 pathway in atherosclerosis[J]. Circ Res， 2018，122（12）：1722-1740.

[21] YU H H， CHENGCHUAN KO E， CHANG C L， et al. Fucoidan inhibits radiation-induced pneumonitis and lung fibrosis by reducing inflammatory cytokine expression in lung tissues[J]. Marine Drugs， 2018，16（10）：392.

[22] DAVIS B K， WEN H T， TING J P Y. The inflammasome NLRS in immunity， inflammation， and associated diseases[J]. Annu Rev Immunol， 2011，29：707-735.

[23] SWANSON K V， DENG M， TING J P Y. The NLRP3 inflammasome： molecular activation and regulation to therapeutics[J]. Nat Rev Immunol， 2019，19（8）：477-489.

[24] ABDERRAZAK A， COUCHIE D， MAHMOOD D F， et al. Anti-inflammatory and antiatherogenic effects of the NLRP3 inflammasome inhibitor arglabin in ApoE2.Ki mice fed a high-fat diet [J]. Circulation， 2015，131（12）：1061-1070.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）