祛風(fēng)除濕方對(duì)特應(yīng)性皮炎小鼠炎性反應(yīng)和皮膚屏障功能的影響及其作用機(jī)制

江 雪，楊富金，錢思宇，劉德明，史丙俊

(重慶市中醫(yī)院/重慶市第一人民醫(yī)院皮膚科，重慶 400011)

特應(yīng)性皮炎(AD)是一種慢性復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚疾病，其發(fā)病率有逐年增高趨勢(shì)。在西方國家，AD 已經(jīng)成為兒童的主要易患疾病，給患兒的家庭和衛(wèi)生醫(yī)療系統(tǒng)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。AD為多因素、多環(huán)節(jié)、多途徑共同作用的一種多基因疾病，發(fā)病機(jī)制主要涉及遺傳、免疫及環(huán)境3個(gè)方面，具體的致病機(jī)制尚不完全明確[2-3]。一方面，皮膚屏障功能的改變會(huì)對(duì)微生物定植的種類和數(shù)量產(chǎn)生影響，另一方面，定植在皮膚表面的微生物可通過多種途徑誘發(fā)炎性反應(yīng)并進(jìn)一步破壞皮膚屏障，二者相互影響、共同參與AD的免疫炎性反應(yīng)過程[4-5]。祛風(fēng)除濕方由防風(fēng)、荊芥、白鮮皮、生地、甘草組成，具有抗炎和抗過敏作用。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)AD小鼠使用祛風(fēng)除濕方進(jìn)行治療，探討其對(duì)AD炎性反應(yīng)和皮膚屏障功能的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 SPF級(jí)6～8周齡雌性Balb/c小鼠20只，體質(zhì)量(17±3)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，于重慶市口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心25 ℃恒溫、封閉、SPF清潔級(jí)飼養(yǎng)。

1.2儀器與試劑 AIRTECH超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，離心機(jī)、流式細(xì)胞儀(艾森生物杭州有限公司)，CK-MPA10多功能皮膚測(cè)試儀(德國CK公司)；小鼠白細(xì)胞介素(IL)-4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢華美生物有限公司)，小鼠IL-6 ELISA試劑盒(武漢華美生物有限公司)，小鼠血清免疫球蛋白E(IgE) ELISA試劑盒(美國R&D公司)，小鼠干擾素-γ(IFN-γ) ELISA試劑盒(美國R&D公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)單克隆抗體(美國santa cruz公司)，IL-1β單克隆抗體(美國santa cruz公司)，凋亡相關(guān)的半胱氨酸肽酶14(Caspase-14)單克隆抗體(美國santa cruz公司)。

1.3治療藥物 祛風(fēng)除濕方：防風(fēng)12 g、荊芥10 g、白鮮皮12 g、生地12 g、甘草6 g；蒸餾水600 mL浸泡3 h，高火煎煮至沸騰后改為溫火煎煮至中藥液濃縮為400 mL，然后再采用蒸餾法濃縮為260 mg/mL，用高溫蒸汽法滅菌后于4 ℃保存?zhèn)溆?。地塞米松：?片劑量為0.75 mg的地塞米松溶于28.8 mL蒸餾水中制成地塞米松懸液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組 將20只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，分別為對(duì)照組、模型組、地塞米松組、祛風(fēng)除濕方組，每組5只。

1.4.2模型制備 4組小鼠均背部剃毛(3×3)cm。 除對(duì)照組外，其他3組分別在實(shí)驗(yàn)第1天、第4天、第8天、第11天給予1%的二硝基氯苯(DNCB)100 μL刺激耳部，分別在第15天、第18天、第21天、第25天、第28天給予0.5% 的DNCB 100 μL刺激背部剃毛區(qū)域。同時(shí)，從第15天開始，對(duì)照組和模型組每天給予2次0.3 mL雙蒸水灌胃；祛風(fēng)除濕方組給予7.83 g/(kg·d)祛風(fēng)除濕方灌胃；地塞米松組給予0.59 mg/(kg·d)地塞米松懸液灌胃。實(shí)驗(yàn)持續(xù)至第29天時(shí)結(jié)束，實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)后測(cè)量小鼠體質(zhì)量，并觀察小鼠一般情況。

1.4.3皮膚搔抓次數(shù) 分別在第8天、第15天、第21天和第28天時(shí)于DNCB刺激30 min后統(tǒng)計(jì)4組小鼠搔抓剃毛區(qū)域的次數(shù)，統(tǒng)計(jì)時(shí)間為10 min，單次反復(fù)搔抓計(jì)為1次。

1.4.4經(jīng)皮水分流失(TWEL)檢測(cè) 平展小鼠背部剃毛區(qū)域，使用Tewameter TM300探頭輕觸小鼠皮膚，待檢測(cè)曲線穩(wěn)定后繼續(xù)檢測(cè)30 s，然后讀取數(shù)值，每只小鼠檢測(cè)3次，取平均值。

1.4.5皮膚組織切片HE染色 取小鼠剃毛區(qū)域皮膚組織置于10%多聚甲醛中固定過夜，將標(biāo)本脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色，鏡下觀察。

1.4.6免疫組織化學(xué)法檢測(cè)皮膚組織中TNF-α表達(dá)水平 石蠟切片進(jìn)行脫蠟，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶后微波抗原修復(fù)，參照免疫組織化學(xué)法試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.7Western blot檢測(cè)皮膚組織中TNF-α、IL-1β、Caspase-14表達(dá)水平 收集小鼠剃毛區(qū)域皮膚組織，提取蛋白進(jìn)行檢測(cè)。按照Western blot步驟進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜；1∶200的TNF-α單克隆抗體、1∶250的IL-1β單克隆抗體、1∶50的Caspase-14單克隆抗體和1∶1 000的β-actin一抗孵育過夜；第2天用磷酸鹽緩沖液洗膜(洗3次，每次5 min)；二抗室溫孵育1 h；配制化學(xué)發(fā)光液，將膜浸泡于發(fā)光液中1 min，置于成像儀中自動(dòng)曝光；采用ImageJ軟件分析目的蛋白與內(nèi)參的比值，即為相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.8ELISA檢測(cè)血漿IL-4、IL-6、IgE、IFN-γ表達(dá)水平 采用ELISA進(jìn)行檢測(cè)，操作過程嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.9實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè) 脾組織中IL-17A、維甲酸相關(guān)孤核受體γt(RORγt)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)表達(dá)水平采用qRT-PCR檢測(cè)，取小鼠脾組織，進(jìn)行研磨，收集脾細(xì)胞，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。分析數(shù)據(jù)，結(jié)果采用相對(duì)定量法2-ΔΔCt計(jì)算。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.14組小鼠造模區(qū)域皮膚情況比較 除對(duì)照組外，其他3組小鼠造模區(qū)域表現(xiàn)為紅斑、稍有水腫，伴有糜爛、結(jié)痂，皮膚表面粗糙，覆以少許糠秕樣鱗屑；經(jīng)藥物治療后，祛風(fēng)除濕方組、地塞米松組小鼠造模區(qū)域癥狀明顯改善，紅斑面積、點(diǎn)狀滲出減少，皮膚彈性恢復(fù)。 4組不同時(shí)間點(diǎn)搔抓次數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；除對(duì)照組外，同一組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)搔抓次數(shù)比較，差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中地塞米松組與祛風(fēng)除濕方組第21天、28天時(shí)搔抓次數(shù)與模型組比較明顯減少(P<0.05)，見表2。4組造模區(qū)域TWEL比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對(duì)照組比較，模型組TWEL明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組與祛風(fēng)除濕方組TWEL明顯降低(P<0.05)；地塞米松組與祛風(fēng)除濕方組TWEL比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

表2 4組不同時(shí)間點(diǎn)搔抓次數(shù)比較次)

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.24組小鼠皮膚組織典型病理改變 HE染色200倍鏡下觀察，模型組皮膚組織棘層增厚，表皮突明顯延長，并有角化過度及角化不全，在表皮內(nèi)有輕度的細(xì)胞間水腫，真皮上部顯示輕度血管周圍炎性反應(yīng)浸潤，以淋巴細(xì)胞居多，毛細(xì)血管數(shù)目增多，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、增多。地塞米松組和祛風(fēng)除濕方組經(jīng)藥物治療后可見皮膚表皮棘層變薄，角質(zhì)層變薄，真皮層炎癥細(xì)胞減少，皮膚炎性反應(yīng)得到緩解，見圖2。

2.34組小鼠皮膚組織中TNF-α、IL-1β、Caspase-14的表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，模型組TNF-α、IL-1β表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，祛風(fēng)除濕方組TNF-α、IL-1β表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，地塞米松組TNF-α表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖3A、3B。模型組Caspase-14表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組、地塞米松組和祛風(fēng)除濕方組(P<0.05)，見圖3C。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TNF-α的結(jié)果顯示，對(duì)照組TNF-α染色面積較小，染色較弱，僅在真皮淺層有少量表達(dá)；模型組真皮層可見大量TNF-α表達(dá)，染色深；經(jīng)藥物治療后，地塞米松組和祛風(fēng)除濕方組真皮層TNF-α染色面積縮小，見圖4。

注：A為對(duì)照組；B為模型組；C為地塞米松組；D為祛風(fēng)除濕方組。

注：A為對(duì)照組TNF-α表達(dá)情況；B為模型組TNF-α表達(dá)情況；C為地塞米松組TNF-α表達(dá)情況；D為祛風(fēng)除濕方組TNF-α表達(dá)情況。

2.44組IL-4、IL-6、IFN-γ及IgE表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組IgE、IL-4、IL-6表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，IFN-γ表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組和祛風(fēng)除濕方組IgE、IL-4、IL-6表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，IFN-γ表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；地塞米松組和祛風(fēng)除濕方組IgE、IL-4、IL-6、IFN-γ表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

2.54組IL-17A、RORγt、Foxp3、TGF-β表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組IL-17A、RORγt表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)oxp3、TGF-β表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組和祛風(fēng)除濕方組IL-17A、RORγt表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，F(xiàn)oxp3、TGF-β表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；地塞米松組和祛風(fēng)除濕方組IL-17A、RORγt、Foxp3、TGF-β表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

注：A為4組IgE表達(dá)水平比較；B為4組IL-4表達(dá)水平比較；C為4組IL-6表達(dá)水平比較；D為4組IFN-γ表達(dá)水平比較；與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

注：A為4組IL-17A表達(dá)水平比較；B為4組RORγt表達(dá)水平比較；C為4組Foxp3表達(dá)水平比較；D為4組TGF-β表達(dá)水平比較；與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3 討 論

AD發(fā)病原因復(fù)雜，與皮膚屏障的破壞、免疫失調(diào)導(dǎo)致皮膚炎性反應(yīng)等均相關(guān)。反復(fù)發(fā)作的劇烈瘙癢和皮疹是AD的主要臨床表現(xiàn)。地塞米松是臨床上用于治療AD急性發(fā)作的藥物，對(duì)急性期瘙癢有較好的控制效果，但長期使用會(huì)出現(xiàn)明顯的免疫抑制作用，因此臨床上僅將其用于短期控制病情，在患者好轉(zhuǎn)后均及時(shí)減量或停藥。中藥被用于治療AD歷史悠久，尤其是在預(yù)防疾病復(fù)發(fā)，保持長期緩解和減輕病情方面有較多優(yōu)勢(shì)。

祛風(fēng)除濕方由防風(fēng)、荊芥、白鮮皮、生地、甘草組成。方中白鮮皮苦寒，用以清熱燥濕、解毒祛風(fēng)；荊芥、防風(fēng)祛風(fēng)解表，透疹止癢；三藥合用，可燥濕、祛風(fēng)、止癢。此外，防風(fēng)、荊芥含多種化學(xué)成分，具有抗炎和抗過敏作用，能抑制DNCB所致的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。甘草、白鮮皮也具有抗炎作用[6]。在皮膚屏障修復(fù)方面，本研究對(duì)藥物治療前后小鼠皮膚屏障功能進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)祛風(fēng)除濕方治療的小鼠皮膚水分流失和瘙癢情況得到明顯改善，且治療效果與地塞米松相仿。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，皮膚屏障修復(fù)相關(guān)的重要蛋白Caspase-14在祛風(fēng)除濕方組中的表達(dá)水平明顯升高。Caspase-14的分布具有皮膚特異性，主要參與表皮細(xì)胞的終末分化和皮膚屏障的形成，故考慮祛風(fēng)除濕方對(duì)AD的治療作用可能與其能夠增加Caspase-14的表達(dá)相關(guān)。

AD作為一種過敏性皮膚疾病，對(duì)環(huán)境抗原的高度敏感性可能導(dǎo)致IgE合成增加，IgE的合成增加與皮膚損傷的嚴(yán)重程度有一定關(guān)聯(lián)。研究表明，IgE水平升高可引起皮膚的急、慢性炎性反應(yīng)，血清總IgE水平升高是AD的重要標(biāo)志，并且與Th1、Th2細(xì)胞失衡相關(guān)[7]。 Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ，介導(dǎo)細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等，介導(dǎo)體液免疫。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，祛風(fēng)除濕方組IgE、IL-4表達(dá)水平明顯降低，IFN-γ表達(dá)水平明顯升高，提示祛風(fēng)除濕方可以降低機(jī)體的過敏反應(yīng)，調(diào)節(jié)Th1、Th2細(xì)胞系統(tǒng)平衡。IL-6是炎性反應(yīng)中重要的前炎癥因子，介導(dǎo)炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展，經(jīng)祛風(fēng)除濕方治療后的小鼠IL-6表達(dá)水平明顯降低，提示祛風(fēng)除濕方可以有效控制炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。此外，地塞米松組和祛風(fēng)除濕方組IgE、IL-4、IL-6、IFN-γ表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示在控制AD的炎性反應(yīng)、過敏反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)上，地塞米松和祛風(fēng)除濕方的治療效果無明顯差異。

IL-1β是IL-1家族成員，也是重要的促炎因子，IL-1的活性主要由IL-1β介導(dǎo)。當(dāng)機(jī)體受到過敏原刺激后可分泌大量的IL-1β，導(dǎo)致TNF-α的分泌增加，參與AD的發(fā)生、發(fā)展。TNF-α是一種多向性的促炎因子，由多種細(xì)胞分泌，可刺激單核-巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分泌IL-1β，促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，祛風(fēng)除濕方組IL-1β和TNF-α表達(dá)水平明顯降低，提示祛風(fēng)除濕方可以有效控制炎性反應(yīng)的發(fā)生，緩解AD的臨床癥狀，改善皮損情況。

AD在免疫失調(diào)方面主要表現(xiàn)為Th1、Th2細(xì)胞系統(tǒng)失衡。既往研究表明，Th2細(xì)胞的異常表達(dá)是AD的一個(gè)重要發(fā)病因素，但是在亞洲人群中，Th17細(xì)胞合并Th2細(xì)胞的異常表達(dá)更為突出[8]。Th17細(xì)胞通過分泌TNF-α、IL-17、IL-21、IL-22等細(xì)胞因子發(fā)揮生理和病理作用，可介導(dǎo)炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤和移植物抗宿主反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展[9-10]。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的主要效應(yīng)因子，可參與炎性反應(yīng)相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，其主要類型包括IL-17A和IL-17F。本研究中，與對(duì)照組比較，模型組IL-17A表達(dá)水平降低，提示Th17細(xì)胞在AD發(fā)生時(shí)處于一種抑制狀態(tài)，IL-17A分泌減少。既往研究表明，Th17細(xì)胞的異常表達(dá)是AD的發(fā)病機(jī)制之一[11-12]。IL-17可通過刺激上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，參與AD的皮膚重塑過程[13-14]；AD病程發(fā)展為慢性時(shí)，Th17細(xì)胞又可分泌IL-17，對(duì)患者的皮膚屏障進(jìn)行修復(fù)[15]。本研究中，與模型組比較，祛風(fēng)除濕方組IL-17A表達(dá)水平升高，提示祛風(fēng)除濕方可能通過調(diào)節(jié)IL-17A的表達(dá)水平來進(jìn)行皮膚屏障修復(fù)，改善皮損情況。IL-17A和IL-17F在過敏反應(yīng)中發(fā)揮的作用可能略有不同，而IL-17F的作用還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

TGF-β參與誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖，介導(dǎo)免疫抑制作用；AD患者外周血Foxp3、RORγt mRNA水平及血清中相應(yīng)細(xì)胞因子水平發(fā)生變化參與了AD的發(fā)生、發(fā)展[10-11]；在TGF-β單獨(dú)作用下，初始CD4+T細(xì)胞中Foxp3和RORγt均表達(dá)增加。本研究中，與對(duì)照組比較，模型組RORγt表達(dá)水平降低，F(xiàn)oxp3、TGF-β表達(dá)水平升高；與模型組比較，祛風(fēng)除濕方組RORγt表達(dá)水平升高，F(xiàn)oxp3、TGF-β表達(dá)水平降低。提示祛風(fēng)除濕方可能是通過調(diào)控RORγt、FoxP3、TGF-β的表達(dá)而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的作用。

4 結(jié) 論

祛風(fēng)除濕方治療AD的效果較好，與地塞米松無明顯差異，能有效減輕患處皮膚水分流失，減少瘙癢，修復(fù)皮膚屏障，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫、控制炎性反應(yīng)等有關(guān)。