北京地區(qū)GPC3參考區(qū)間的建立及驗證

董美襯，劉向祎

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院檢驗科，北京 100730;2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院檢驗科，北京 100091)

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是一種細胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖，屬于與甘氨酸相關(guān)的整體膜蛋白多糖親緣蛋白。GPC3通常在胎兒肝臟和胎盤中表達，在健康成人肝臟中不表達，但在肝癌患者的肝臟中呈高度表達。GPC3對診斷肝癌有著較高的靈敏度和特異度，同時在監(jiān)測肝癌預(yù)后和復(fù)發(fā)中也有重要價值[1-2]。參考區(qū)間是臨床判斷受檢者健康與否的依據(jù)，其準確性、適用性直接影響著疾病的診療效率。參考區(qū)間的不確定會導(dǎo)致錯誤的醫(yī)學(xué)判斷和干預(yù)，導(dǎo)致漏診患者錯過最佳治療時機，導(dǎo)致誤診患者承擔不應(yīng)有的心理和經(jīng)濟負擔。目前，我國腫瘤標志物的檢測系統(tǒng)和檢測方法不統(tǒng)一，研究表明，約83.1%的實驗室指標參考區(qū)間來自檢測系統(tǒng)說明書，且各檢測系統(tǒng)的參考區(qū)間之間存在明顯差異[3]。因此，各實驗室應(yīng)建立適合于該地區(qū)人群的參考區(qū)間，以提高診斷的準確性。本研究建立了適用于北京地區(qū)健康人群的GPC3參考區(qū)間，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年11月至2019年1月于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院體檢中心健康體檢者198例為研究對象，其中男112例，女86例。納入標準：根據(jù)《臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定：WS/T 402-2012》[4]標準剔除離群值；血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能、血糖、血脂均正常，腹部B超、胸部CT無異常，既往無肝、膽、胃、腸、胰腺疾病及慢性疾病史，無家族遺傳疾病史。所有研究對象中19～<30歲者65例，其中男50例，女15例；30～<40歲者55例，其中男30例，女25例；40～<50歲者27例，其中男11例，女16例；50～<60歲者29例，其中男14例，女15例；≥60歲者22例，其中男7例，女15例。另收集2019年1月于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院體檢中心健康體檢者20例對建立的參考區(qū)間進行驗證。

1.2儀器與試劑 儀器包括大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司生產(chǎn)的Top Pette移液器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)的Mini Shaker MH-1微孔板振蕩器，北京拓普分析儀器有限責任公司生產(chǎn)的DEM-3型自動酶標洗板機和奧地利Tecan公司生產(chǎn)的Tecan sunrise酶標儀。試劑包括康乃格診斷產(chǎn)品(北京)有限公司生產(chǎn)的GPC3試劑、配套校準品和質(zhì)控品，試劑盒批號為41651U。

1.3方法

1.3.1標本采集 所有研究對象禁食8 h后于清晨采集5 mL靜脈血，置于分離膠促凝采血管中，離心分離血清，于-80 ℃冰箱保存待測。

1.3.2標本檢測 將冷凍血清標本恢復(fù)至室溫，待完全溶化后充分混勻備用。用清洗緩沖液清洗微孔板1次，將100 μL GPC3校準品、GPC3質(zhì)控品及待測標本加至微孔中；然后向各個微孔中加入50 μL生物素抗GPC3溶液，振蕩2 h，清洗3次；向各個微孔中加入100 μL示蹤劑，振蕩1 h，清洗6次；向每個微孔中加入100 μL TMB HRP底物，振蕩30 min，再向各個微孔中加入100 μL終止液；加入終止液15 min內(nèi)，使用微孔板分光光度計讀取450 nm處的吸光度值，使用曲線擬合法計算檢測結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗進行正態(tài)性驗證；不符合正態(tài)分布的計量資料以M(P25，P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗；以P5作為參考區(qū)間下限，以P95作為參考區(qū)間上限。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同性別及年齡人群GPC3水平及參考區(qū)間 納入人群GPC3水平呈偏態(tài)分布(P<0.05)；人群總體GPC3水平為[0.006(0.000，0.015)]ng/mL,參考區(qū)間為0.000～0.036 ng/mL；男女GPC3水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.618，P=0.106)；男性GPC3參考區(qū)間為0.000～0.028 ng/mL，女性GPC3參考區(qū)間為0.000～0.040 ng/mL，見表1。GPC3水平隨年齡增長有下降趨勢，但不同年齡段人群GPC3水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(H=4.144，P=0.387)；不同年齡段人群GPC3水平及參考區(qū)間見表2。

表1 不同性別人群GPC3水平及參考區(qū)間

表2 不同年齡人群GPC3水平及參考區(qū)間

2.2參考區(qū)間驗證 按照《臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定：WS/T 402-2012》[4]中的相關(guān)要求，對所建立的GPC3參考區(qū)間進行驗證，結(jié)果顯示，另收集的健康體檢者20例GPC3水平均處于所建立的參考區(qū)間范圍內(nèi)。

3 討 論

腫瘤標志物在臨床應(yīng)用中具有重要意義，規(guī)范腫瘤標志物在腫瘤臨床診療中的科學(xué)使用，是臨床與檢驗共同關(guān)心的問題[5]。GPC3作為早期診斷肝癌的理想標志物，能夠彌補現(xiàn)有肝癌腫瘤標志物甲胎蛋白、甲胎蛋白異質(zhì)體3等靈敏度和特異度不高的缺點，聯(lián)合檢測更能提高對肝癌的診斷效能[6]。1項關(guān)于GPC3的Meta分析發(fā)現(xiàn)，GPC3診斷肝癌的特異度很高，靈敏度中等，診斷效能較好[7-8]。

目前，GPC3還沒有明確的標準化臨界值，所以建立合適的參考區(qū)間，尋找合理的臨界值，是亟待解決的問題。建立參考區(qū)間時所納入的健康人群不可能是絕對健康的，且目前還沒有相關(guān)標準明確規(guī)定一定要納入完全健康的個體，故只要不存在相關(guān)疾病和干擾研究項目的因素，即可納入作為研究對象，同時可通過離群值的剔除來提高參考區(qū)間準確性[9]。本研究對北京地區(qū)198例健康體檢者血清GPC3水平進行檢測，得出參考區(qū)間為0.000～0.036 ng/mL,與廠家提供的數(shù)據(jù)一致，但與費樂學(xué)等[10]、田江川[11]所建立的參考區(qū)間有明顯差異，考慮與以下因素相關(guān)：各研究所用的檢測試劑不同，費樂學(xué)等[10]的研究中，采用的是上海通蔚試劑公司生產(chǎn)的GPC3檢測試劑盒，田江川[11]的研究中所用試劑由武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司提供，而本研究使用的是康乃格診斷產(chǎn)品(北京)有限公司生產(chǎn)的GPC3試劑、配套校準品和質(zhì)控品。此外，檢測儀器及研究對象的納入及排除標準也會影響參考區(qū)間的結(jié)果。其他部分研究對健康人群與疾病患者的GPC3水平進行了相關(guān)比較，雖未明確標明參考區(qū)間，但從健康人群的GPC3數(shù)據(jù)來看，各研究有很大區(qū)別[12-15]，這些差異的產(chǎn)生可能與研究對象的納入差異、檢測試劑、方法、儀器、實驗環(huán)境，以及選擇樣本量的不同等諸多因素有關(guān)，因此，實驗室建立符合要求的參考區(qū)間是十分必要的。

本研究中，女性GPC3水平略高于男性，且隨著年齡的增長GPC3水平有下降趨勢，雖然差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但針對該結(jié)果可進一步擴大樣本量去證實不同性別、年齡的健康人群是否存在GPC3的水平差異。本研究參考區(qū)間驗證結(jié)果符合行業(yè)標準，能滿足實驗室檢測需求，可提高臨床診斷準確性。